3.2 小肽飼料價值指標的測定方法 3.2.1 小肽總含量的測定方法 3.2.1.1 雙縮脲法 雙縮脲法的原理是利用蛋白質和肽分子中含有的肽鍵（CO-NH-）具有雙縮脲反應的特性。在堿性溶液中蛋白質或肽與Cu2+形成紫紅色的絡合物，絡合物顏色的深淺與其濃度成正比。所以它是蛋白質和肽類物質的特異性測定方法。雙縮脲法測定靈敏度不高，一般測試濃度在1～10 mg/ml之間。此法尤其適合于肽類物質的測定，但只能測定二肽以上的肽, 造成測定結果偏低。對于小肽來說，雙縮脲法會把三肽以上的肽也算在小肽里面，因此只適合可以確定飼料中只含有三肽的飼料。 3.2.1.2 福林-酚法（Lowry法） 福林-酚法是在雙縮脲法的基礎上發展起來的。首先是在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色的絡合物，然后該絡合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應產生深藍色溶液。此法適合于蛋白類的定量分析，靈敏度較高，檢測低限為5 μg，通常測定范圍在20～250 μg之間，但專一性不強。同雙縮脲法一樣，此法也只適合可以確定飼料中只含有三肽的小肽飼料的檢測。 3.2.1.3 三氯乙酸（TCA）法 三氯乙酸法的原理是利用大分子的蛋白質在TCA溶液中沉淀，除去酸不溶蛋白質，然后測定酸溶蛋白含量。國外大量資料表明，在蛋白質酶水解的研究中測定水解度，通常在酶解液中加入TCA溶液，使未水解的大分子蛋白質沉淀，而與小分子的酸溶蛋白成分，即肽類和FAA離開，測定酸溶蛋白占總蛋白的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占總蛋白的百分比。日本某公司將TCA可溶蛋白做為大豆肽的常規檢測方法。大豆肽粉行業標準中酸溶蛋白質的測定方法就是將肽粉經酸沉處理后用國家標準（GB14771-1993）的方法測定酸溶蛋白，游離氨基酸含量測定方法采用GB/T14965食物中氨基酸的測定方法，酸溶蛋白質含量減游離氨基酸含量即為大豆肽含量。 3.2.2 平均肽鏈長度的測定 測定平均肽鏈長度需要測定α-氨基氮（α-NH2-N）含量和總氮（TN）含量。用甲醛滴定法測定α-NH2-N含量，總氮用凱氏定氮法測定。然后計算平均肽鏈長度，公式如下： 3.2.3 特定小肽和氨基酸含量的測定 3.2.3.1 紫外光吸收法 分子中含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸等）的肽，在280 nm處有最大吸收峰。肽在最大吸收峰λmax波長處的吸光值的強弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合對分子中含有芳香族氨基酸的肽進行定量分析，對不含芳香族氨基酸的肽靈敏度較低。 3.2.3.2 消光系數法 分子中含有芳香族氨基酸殘基的肽，在280 nm處有特定吸光值。肽分子中所含氨基酸數量不同，它們在280 nm處吸光值的強弱就有差異。因此，每一種純的單一肽在280 nm處有一個特定的消光系數。如果已知某個小肽的消光系數，只要在280 nm處測定出該蛋白吸光值就可以計算出其相應的含量。 3.2.3.3 考馬斯亮蘭法（Bradford法） 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其它幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變為595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。經研究后人們認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595 nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。Bradford法的突出優點是：①靈敏度高，據估計比Lowry法約高4倍；②測定快速、簡便，只需加一種試劑，完成一個樣品的測定只需要5 min左右；③干擾物質少，此法可以用來測定含堿性氨基酸的肽的含量。 3.2.3.4 層析比色法 通過層析柱將不同分子量的肽或氨基酸一一分開，用比色法測定其濃度，再采用已知分子量的肽類和氨基酸做標準曲線，從而計算出一定分子量范圍內肽類的含量。該方法與以前的方法相比有很大的進步，但基本上仍屬化學法，操作繁瑣，人為誤差較大。 3.2.3.5 高效凝膠色譜法（HPGC） 該法在層析比色法的基礎上，進行了儀器自動化的改進，準確性高、重現性好、數據處理科學，能真實地表示出蛋白質和肽類的分子量分布。分子量分布的測定不但能定性地鑒定肽類產品的優劣、真偽，而且能定量的表示出不同分子量范圍的肽的百分含量。國家藥品標準《轉移因子溶液》WS1—XG—036—2000 中，將該方法做為轉移因子（一種肽類）的標準分析方法。 3.2.3.6 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法是20世紀60年代發展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發展，目前已成為應用極為廣泛的重要化學分離分析手段，是常用的小肽分析方法。高效液相色譜法分為兩種；一種用反相C18柱，用乙睛和0.1% TFA或高氯酸的水溶液進行梯度洗脫分離，有的還需加入十二烷基磺酸鈉；另一種是以分離氨基酸的經典反相高效液相色譜（HPLC）條件，對小肽進行柱前或柱后衍生化來進行測定。鄒娟娟等研究了反相HPLC 分離分析化學合成的O8肽的方法。歐宇認為HPLC測定小肽含量簡便、準確，結果穩定，可以用來測定已知小肽在瘤胃中的釋放情況。馮健等使用HPLC法測定草魚血漿肽和蝦蛋白肽中小肽總量。但是該法成本高、耗時長，不適用一般飼料企業的快速測定。劉慶生等研究了新型離子色譜的氨基酸分析系統和積分脈沖安培檢測對小肽的檢測，結果發現此方法無需衍生，可以直接分離測定小肽和氨基酸，而且操作簡單、重現性好，其流動相為水、氫氧化鈉和醋酸鈉溶液，有環境污染小、危險性小和排放少等優點。 3.2.3.7 CE-ESI-MS聯用法 毛細管電泳（CE）作為一種高效、快速的分離方法，樣品用量少，已被廣泛應用于小肽和蛋白質的分離分析。質譜（MS）能夠進行微量鑒定，并提供精確的分子量和結構信息，使其成為小肽和蛋白質檢測及序列測定強有力的支撐技術之一。其中的電噴霧（ESI）質譜作為一種軟電離技術，易與常規的高分辨率分離方法如高效液相色譜、毛細管電泳等實現在線聯用，具有分離效率高、檢測靈敏度高和樣品定性方便等特點，因而在小肽和蛋白質的測定中得到廣泛的應用。梁振等研究了CE-ESI-MS聯用測定小肽混合物的技術，其檢測限可達4.2~33 pg。 4 總結 隨著小肽制品商業化的不斷深入，制定科學、統一的小肽標準，對小肽飼料進行營養價值的評定已非常必要。科學的測定方法是小肽標準的制定和使用的保證。明確小肽的概念，了解影響小肽飼料營養價值的因素是評定小肽價值的前提，在此基礎上我們要選擇必要的測定指標，然后篩選相應的測定方法。目前，測定小肽含量的方法有很多種，但從中發展出一套科學有效的測定方法做為小肽標準的尺度仍是一個艱難的任務，有待進一步的研究。 |
京公網安備 11010802025824號