小肽飼料營養價值及評價方法

bighamburger · 發表于 2010-7-11 17:58:43

　　傳統的代謝模型認為蛋白質必須水解成氨基酸后才能被吸收利用，飼料中氨基酸比例符合理想蛋白質模型就能獲得最大的營養效果。但近些年的研究表明，不同來源的飼料氨基酸利用率存在差異，而且在給動物喂以按理想氨基酸模式配制的純合日糧或低蛋白質氨基酸平衡日糧時，不能獲得最佳生產性能。現代研究認為，蛋白質在動物消化酶作用下的水解終產物大部分是由2個或3個氨基酸殘基組成的小肽，它們以完整的形式被吸收進入循環系統而被組織利用。以此理論為基礎，很多飼料企業開發了小肽飼料，做為飼料添加劑應用于動物飼料中。但是到目前為止，小肽市場仍十分混亂，小肽產品良莠不齊，這歸根結底是由于缺乏小肽營養標準。而科學的營養價值評價方法是營養標準的前提，本文對制定合適的小肽營養價值評價方法進行了一些探索，綜述了評價小肽營養價值的指標和測定方法。

　　1 小肽和小肽飼料的概念

　　評價小肽飼料的營養價值，首先要對小肽和小肽飼料的概念有一個明確的定義。肽是氨基酸的線性聚合物，含氨基酸殘基50 個以上的通常稱為蛋白質，低于50 個氨基酸殘基的稱為肽。最簡單的肽由兩個氨基酸殘基組成，稱為二肽（dipeptide），其中含一個肽鍵。含3個、4個、5個氨基酸殘基的肽分別稱為三肽、四肽、五肽。通常把含幾個至十幾個氨基酸殘基的肽鏈統稱為寡肽（oligopeptide），更長的肽鏈稱為多肽（polypeptide）。有的學者把超過12個而不多于20個氨基酸殘基的稱寡肽，含20個以上氨基酸殘基的稱為多肽。在動物營養學上一般認為“含2個或3個氨基酸殘基的肽為小肽”。小肽飼料是一種功能營養性添加劑，也稱為小肽營養素。小肽飼料的產生是基于現代營養學的研究成果。研究者認為，蛋白質在消化道中的消化終產物的大部分往往是小肽而不是游離氨基酸(FAA)。小肽能完整地通過腸粘膜細胞進入體循環。小肽的吸收具有轉運速度快、耗能低、載體不易飽和等優點，且各種肽之間轉運無競爭性與抑制性。小肽也是組織內氨基酸的重要來源之一，動物組織可以直接利用小肽中的氨基酸合成組織蛋白。根據這些研究結果，可以確定小肽是一種更優質的氮源。于是人們開始研究如何生產小肽飼料。在當前的生產工藝下，小肽飼料就是通過化學或生物方法將本來不適合動物利用的蛋白原料分解，制成的含有大量小肽的飼料產品。現在生產小肽飼料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物發酵法三條途徑。酸解法通過強酸、強堿的作用分解大分子蛋白為小分子肽，由于強酸、強堿具有腐蝕性, 該法會帶來大量的污染；酶解法利用酶的定向分解的特性將大分子蛋白分解為小分子肽；微生物發酵法是利用微生物的生化反應將蛋白轉化為肽。僅就制備小肽來說還有化學合成法、重組DNA法等，但目前仍不適合商業化生產。

　　目前市場上很多小肽飼料并不符合小肽的定義，簡單地把寡肽甚至分子量較小的多肽稱為小肽，這樣做忽略了小肽和寡肽、多肽的區別。肽鏈的長度是影響肽吸收的原因之一，肽轉運主要限于二肽、三肽, 對長鏈肽大量轉運的可能性很小，這樣的飼料產品其實并不具有小肽在吸收方面的特點。

　　2 影響小肽飼料營養價值的因素

　　作為一種飼料產品，小肽飼料的營養價值一方面在于小肽在吸收方面相對于FAA的巨大優勢，另一方面取決于飼料本身的質量。

　　2.1 影響小肽吸收的因素

　　2.1.1 肽鏈的長度

　　目前的研究認為，二肽和三肽能被完整的吸收，但三肽以上的寡肽是否能完整吸收還有爭議。Grimble 等報道，腸道對大于三肽的寡肽吸收慢于小肽，腸道內胰蛋白酶、肽酶對其進一步水解可能是寡肽吸收的主要限速反應。當蛋白質水解產物中的寡肽和FAA所占比例較高時，寡肽能誘導腸肽酶的分泌，在腸肽酶的進一步作用下水解釋放出FAA，使FAA的濃度提高，從而加劇 FAA吸收的競爭抑制，進一步減慢肽的吸收速率。但是，反芻動物瘤胃細菌對大分子肽的攝取速度比小分子肽和氨基酸攝取速度快，且利用效率更高，雖然細菌對低分子量的蛋白質降解產物（小分子量的肽和氨基酸）發酵較快，但大分子肽更容易轉化為菌體蛋白質。

　　2.1.2 肽的氨基酸殘基組成

　　肽的氨基酸殘基組成是影響肽吸收的另一個重要因素。當賴氨酸(Lys)與甘氨酸(Gly)形成二肽時，Lys處于N端比處于C端吸收得更快；而Lys 與谷氨酸(Glu)形成二肽時，Lys處于C端時吸收更為迅速。L型小肽比D型小肽更易被動物吸收，中性小肽比酸、堿性小肽更易被動物吸收。當肽是由疏水性且體積較大的底物如Met和Phe構成時，載體對肽就有較高的親合力，因而轉運速度較快；而親水性且帶電荷的小肽，載體對其親合力較小，所以轉運速度較慢。樂國偉等研究發現，含疏水性的苯丙氨酸的肽類對肽載體的親和力高，以肽形式吸收可能是苯丙氨酸吸收本身的需要。

　　Broderick等研究了混合瘤胃微生物對中性肽的代謝，發現含有3個丙氨酸殘基的肽代謝最快，其次是Leu(Gly)2、Gly(Ala)2，然后是其它中性三肽、二肽代謝速度相似，但Gly-Pro較慢，(Ala)2代謝較Gly-Pro快；在由丙氨酸殘基構成的肽中，三肽代謝速度大于四肽，然后是五肽，二肽最慢。由此可見，肽鏈的氨基酸序列對肽的利用率也有影響。通過研究Lys-Pro肽、Lys-Ala肽、Met-Ala肽的效應發現，前兩種肽的代謝速度比后一種肽慢4倍。

　　2.1.3 肽的來源

　　程茂基等通過體外培養發現，反芻動物對瘤胃液肽的攝取量和攝取率顯著高于大豆肽（P<0.05）和玉米肽(P<0.05)，表明肽來源不同能影響其吸收和利用。

　　2.2 決定小肽飼料質量的因素

　　2.2.1 小肽飼料中小肽的含量

　　小肽是小肽飼料中的有效成分。不同生產工藝下小肽飼料中小肽的含量是不同的，小肽含量的高低決定了小肽飼料的營養價值。小肽含量既要求飼料中要有足夠的肽，又對這些肽的分子量有要求。

　　2.2.2 小肽飼料中高價值氨基酸的含量

　　小肽最終是要進入動物體內充當動物組織蛋白的氨基酸殘基。不同的氨基酸在體內的重要性大不相同。以賴氨酸、蛋氨酸等限制性氨基酸的殘基為主要組成成分的小肽必然具有更高的營養價值。另外，一些氨基酸之間存在拮抗作用，包含這些氨基酸殘基的小肽其營養價值也會高于其它小肽。

　　2.2.3 小肽飼料的特殊功能

　　除了作為蛋白飼料應具有的營養價值外，小肽飼料還有許多其它的功能。首先，小肽能促進微量元素的吸收。以小肽為主要配體的微量元素螯合物，利用小肽的吸收轉運機制和特點，可能以整體的形式被轉運，因而能夠促進微量元素的吸收，更有利于微量元素生物學效價的提高。大量的研究表明，小肽絡合物形式的礦物離子更易被機體吸收，而且小肽螯合物的穩定性較氨基酸螯合鹽（AAC）更高。其次，小肽能促進動物對其它營養物質的消化率。Siddons（1975）通過在綿羊日糧中添加不同水平的小肽蛋白替代植物蛋白（各處理組總蛋白水平相同），發現動物對能量的利用率有顯著的提高（P<0.05）。再次，小肽能提高動物的生產性能。施用暉等報道，在蛋雞基礎日糧中添加肽制品后，其產蛋率和飼料轉化率顯著提高，蛋殼強度也有提高的趨勢。曹志軍等試驗結果表明，荷斯坦牛日糧中添加小肽比不添加小肽能較明顯地提高乳蛋白率（P<0.05），同時添加保護性小肽比添加普通小肽產奶量提高10.91%。王恬等試驗表明，添加小肽營養素后，無論是乳蛋白還是乳脂率，試驗組均比對照組有所提高，且隨著小肽營養素添加濃度的增加有提高的趨勢，小肽營養素對乳品質的提高具有一定的促進作用。不同小肽在這些生理功能中的貢獻是不一樣的，因此某些特定種類的小肽的含量決定了小肽飼料的特定功能。

　　3 小肽營養價值的評價指標及測定方法

　　3.1 評價小肽飼料價值的指標

　　根據小肽的概念和影響其價值的因素，我們可以把小肽飼料的營養品質分成以下幾個方面進行考慮。

　　3.1.1 小肽的總含量

　　所有的小肽飼料都含有載體、稀釋劑等成分，其比例根據產品的生產方式、廠家及市場定位而有所不同。小肽是飼料中的有效成分，它在飼料中所占的比例是影響小肽飼料質量的最重要因素，因此必須測定飼料中小肽的總含量。

　　3.1.2 平均肽鏈長度

　　小肽指的是二肽或三肽，大于三肽的并不容易被動物機體吸收。許多小肽飼料中的肽其實是寡肽和多肽，這些肽分子仍然要經過消化后才能吸收，飼料中平均肽鏈長度是影響小肽質量的一個重要因素，反映了飼料中有效小肽所占的比例。

　　3.1.3 特定小肽的含量

　　小肽由20多種氨基酸殘基中的兩個或三個構成，這些氨基酸殘基的任意一種組合都是一種特定的小肽，再加上不同的分子構象，小肽的家族非常龐大。不同小肽被吸收的能力、營養價值和生理功能并不相同。因此測定特定小肽的含量也是評價小肽營養價值的重要指標。

　　3.1.4 特定氨基酸的含量

　　對動物機體來說，不同的氨基酸具有不同的價值。小肽作為動物體內蛋白質的氨基酸來源，其所包含的氨基酸決定了飼料的價值，因此小肽飼料中特定氨基酸的含量也是一個非常重要的指標。

　　3.2 小肽飼料價值指標的測定方法

　　3.2.1 小肽總含量的測定方法

　　3.2.1.1 雙縮脲法

　　雙縮脲法的原理是利用蛋白質和肽分子中含有的肽鍵（CO-NH-）具有雙縮脲反應的特性。在堿性溶液中蛋白質或肽與Cu2+形成紫紅色的絡合物，絡合物顏色的深淺與其濃度成正比。所以它是蛋白質和肽類物質的特異性測定方法。雙縮脲法測定靈敏度不高，一般測試濃度在1～10 mg/ml之間。此法尤其適合于肽類物質的測定，但只能測定二肽以上的肽, 造成測定結果偏低。對于小肽來說，雙縮脲法會把三肽以上的肽也算在小肽里面，因此只適合可以確定飼料中只含有三肽的飼料。

　　3.2.1.2 福林-酚法（Lowry法）

　　福林-酚法是在雙縮脲法的基礎上發展起來的。首先是在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色的絡合物，然后該絡合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應產生深藍色溶液。此法適合于蛋白類的定量分析，靈敏度較高，檢測低限為5 μg，通常測定范圍在20～250 μg之間，但專一性不強。同雙縮脲法一樣，此法也只適合可以確定飼料中只含有三肽的小肽飼料的檢測。

　　3.2.1.3 三氯乙酸（TCA）法

　　三氯乙酸法的原理是利用大分子的蛋白質在TCA溶液中沉淀，除去酸不溶蛋白質，然后測定酸溶蛋白含量。國外大量資料表明，在蛋白質酶水解的研究中測定水解度，通常在酶解液中加入TCA溶液，使未水解的大分子蛋白質沉淀，而與小分子的酸溶蛋白成分，即肽類和FAA離開，測定酸溶蛋白占總蛋白的含量，求得水解度，即酸溶蛋白占總蛋白的百分比。日本某公司將TCA可溶蛋白做為大豆肽的常規檢測方法。大豆肽粉行業標準中酸溶蛋白質的測定方法就是將肽粉經酸沉處理后用國家標準（GB14771-1993）的方法測定酸溶蛋白，游離氨基酸含量測定方法采用GB/T14965食物中氨基酸的測定方法，酸溶蛋白質含量減游離氨基酸含量即為大豆肽含量。

　　3.2.2 平均肽鏈長度的測定

　　測定平均肽鏈長度需要測定α-氨基氮（α-NH2-N）含量和總氮（TN）含量。用甲醛滴定法測定α-NH2-N含量，總氮用凱氏定氮法測定。然后計算平均肽鏈長度，公式如下：

　　3.2.3 特定小肽和氨基酸含量的測定

　　3.2.3.1 紫外光吸收法

　　分子中含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸等）的肽，在280 nm處有最大吸收峰。肽在最大吸收峰λmax波長處的吸光值的強弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合對分子中含有芳香族氨基酸的肽進行定量分析，對不含芳香族氨基酸的肽靈敏度較低。

　　3.2.3.2 消光系數法

　　分子中含有芳香族氨基酸殘基的肽，在280 nm處有特定吸光值。肽分子中所含氨基酸數量不同，它們在280 nm處吸光值的強弱就有差異。因此，每一種純的單一肽在280 nm處有一個特定的消光系數。如果已知某個小肽的消光系數，只要在280 nm處測定出該蛋白吸光值就可以計算出其相應的含量。

　　3.2.3.3 考馬斯亮蘭法（Bradford法）

　　1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其它幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變為595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。經研究后人們認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595 nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。Bradford法的突出優點是：①靈敏度高，據估計比Lowry法約高4倍；②測定快速、簡便，只需加一種試劑，完成一個樣品的測定只需要5 min左右；③干擾物質少，此法可以用來測定含堿性氨基酸的肽的含量。

　　3.2.3.4 層析比色法

　　通過層析柱將不同分子量的肽或氨基酸一一分開，用比色法測定其濃度，再采用已知分子量的肽類和氨基酸做標準曲線，從而計算出一定分子量范圍內肽類的含量。該方法與以前的方法相比有很大的進步，但基本上仍屬化學法，操作繁瑣，人為誤差較大。

　　3.2.3.5 高效凝膠色譜法（HPGC）

　　該法在層析比色法的基礎上，進行了儀器自動化的改進，準確性高、重現性好、數據處理科學，能真實地表示出蛋白質和肽類的分子量分布。分子量分布的測定不但能定性地鑒定肽類產品的優劣、真偽，而且能定量的表示出不同分子量范圍的肽的百分含量。國家藥品標準《轉移因子溶液》WS1—XG—036—2000 中，將該方法做為轉移因子（一種肽類）的標準分析方法。

　　3.2.3.6 高效液相色譜法（HPLC）

　　高效液相色譜法是20世紀60年代發展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發展，目前已成為應用極為廣泛的重要化學分離分析手段，是常用的小肽分析方法。高效液相色譜法分為兩種；一種用反相C18柱，用乙睛和0.1% TFA或高氯酸的水溶液進行梯度洗脫分離，有的還需加入十二烷基磺酸鈉；另一種是以分離氨基酸的經典反相高效液相色譜（HPLC）條件，對小肽進行柱前或柱后衍生化來進行測定。鄒娟娟等研究了反相HPLC 分離分析化學合成的O8肽的方法。歐宇認為HPLC測定小肽含量簡便、準確，結果穩定，可以用來測定已知小肽在瘤胃中的釋放情況。馮健等使用HPLC法測定草魚血漿肽和蝦蛋白肽中小肽總量。但是該法成本高、耗時長，不適用一般飼料企業的快速測定。劉慶生等研究了新型離子色譜的氨基酸分析系統和積分脈沖安培檢測對小肽的檢測，結果發現此方法無需衍生，可以直接分離測定小肽和氨基酸，而且操作簡單、重現性好，其流動相為水、氫氧化鈉和醋酸鈉溶液，有環境污染小、危險性小和排放少等優點。

　　3.2.3.7 CE-ESI-MS聯用法

　　毛細管電泳（CE）作為一種高效、快速的分離方法，樣品用量少，已被廣泛應用于小肽和蛋白質的分離分析。質譜（MS）能夠進行微量鑒定，并提供精確的分子量和結構信息，使其成為小肽和蛋白質檢測及序列測定強有力的支撐技術之一。其中的電噴霧（ESI）質譜作為一種軟電離技術，易與常規的高分辨率分離方法如高效液相色譜、毛細管電泳等實現在線聯用，具有分離效率高、檢測靈敏度高和樣品定性方便等特點，因而在小肽和蛋白質的測定中得到廣泛的應用。梁振等研究了CE-ESI-MS聯用測定小肽混合物的技術，其檢測限可達4.2~33 pg。

　　4 總結

　　隨著小肽制品商業化的不斷深入，制定科學、統一的小肽標準，對小肽飼料進行營養價值的評定已非常必要。科學的測定方法是小肽標準的制定和使用的保證。明確小肽的概念，了解影響小肽飼料營養價值的因素是評定小肽價值的前提，在此基礎上我們要選擇必要的測定指標，然后篩選相應的測定方法。目前，測定小肽含量的方法有很多種，但從中發展出一套科學有效的測定方法做為小肽標準的尺度仍是一個艱難的任務，有待進一步的研究。