飼用酶檢測(cè)過程中非定義影響因素的分析

apple12151007 · 發(fā)表于 2010-9-27 14:35:50

　　飼用酶檢測(cè)過程中非定義影響因素的分析

　　湯海鷗汪勇李富偉

　　Analysis of influence factors not included in definition during enzyme activity test
　　Tang Haiou, Wang Yong, Li Fuwei
　　飼用酶制劑是應(yīng)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，選用特殊的微生物菌株經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的具有催化活性的生物制劑。近年來，因其具有改善畜禽消化道功能、降低食糜粘度和抗?fàn)I養(yǎng)性、提高飼料利用率和減少環(huán)境污染等特點(diǎn)，已作為環(huán)保型飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。但因飼用酶制劑應(yīng)用開發(fā)較晚，當(dāng)前飼用酶制劑酶活測(cè)定方法除了植酸酶外其它酶制劑都還沒有一個(gè)全國通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然隨著酶制劑工業(yè)的發(fā)展，酶活檢測(cè)水平已得到了相應(yīng)的提高，對(duì)于酶活檢測(cè)中的一些重要因素人們?cè)诿富疃x中已經(jīng)進(jìn)行了明確的規(guī)定，例如其中的溫度、pH值、時(shí)間、底物等，并且對(duì)于這些因素在酶活測(cè)定過程中對(duì)結(jié)果的影響程度以及這些因素不同值下的對(duì)比關(guān)系，廣大科研工作者已經(jīng)進(jìn)行了大量而深入的研究。但是酶活檢測(cè)過程中除了這些定義中規(guī)定的因素對(duì)酶活檢測(cè)結(jié)果影響很大以外，許多非定義因素對(duì)酶活的檢測(cè)結(jié)果影響也極其顯著。因此，對(duì)于酶制劑酶活大小的判斷和對(duì)比，不能僅僅從定義中規(guī)定的因素進(jìn)行分析，那些非定義因素的分析也至關(guān)重要。有鑒于此，筆者就酶制劑酶活測(cè)定中一些影響酶活測(cè)定值的非定義因素進(jìn)行了分析，并對(duì)其中有些不確定的影響因素進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，以便為廣大的酶制劑應(yīng)用者更好的把握酶制劑的質(zhì)量提供參考。
　　1 緩沖液的配置
　　飼用酶制定義中的pH值的確定都是根據(jù)動(dòng)物的胃腸內(nèi)最佳作用pH值得來，一般在5.0～5.5左右。為了達(dá)到酶活定義所要求的pH值范圍，酶制劑檢測(cè)時(shí)都應(yīng)用一定的緩沖液調(diào)配使反應(yīng)體系達(dá)到相應(yīng)的pH值。反應(yīng)體系中緩沖液的離子強(qiáng)度影響酶制劑的蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而影響其催化能力，所以測(cè)定酶活時(shí)應(yīng)盡可能統(tǒng)一反應(yīng)緩沖液的種類和離子強(qiáng)度。但是在pH相同的條件下如果緩沖液的離子對(duì)和緩沖溶液的摩爾濃度不相同，則測(cè)定出來的酶活差別很大。乙酸緩沖液在酶制劑檢測(cè)中最常使用，但也有方法使用檸檬酸和硼酸等緩沖液。緩沖液摩爾濃度國內(nèi)方法一般用0.1和0.2M的居多，在國外也有使用0.05M的方法。Nelson等(2007)試驗(yàn)證明，使用檸檬酸緩沖液測(cè)定真菌性植酸酶的活性僅相當(dāng)于使用乙酸緩沖液的65～70%。然而，在緩沖液使用上的差異并不對(duì)所有植酸酶都產(chǎn)生相同的影響。Dalsgaard等(2007)發(fā)現(xiàn)，乙酸緩沖液和檸檬酸緩沖液對(duì)兩種大腸桿菌植酸酶的相對(duì)酶活影響區(qū)別很大，用檸檬酸緩沖液分析得到的植酸酶活性只相當(dāng)于用乙酸緩沖液的1/3左右。我們應(yīng)用相同測(cè)定方法不同的兩種的緩沖液測(cè)定同一種木聚糖酶樣品，結(jié)果表明使用乙酸緩沖液測(cè)定的酶活僅相當(dāng)于使用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的60～70%。
　　2 底物的配置
　　底物的差別對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果具有很大影響。底物的選擇最好應(yīng)用酶制劑實(shí)際應(yīng)用時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶解底物為好，但是在實(shí)際檢測(cè)時(shí)因?yàn)榭紤]到底物穩(wěn)定性以及酶活檢測(cè)的方便性等問題，底物的性質(zhì)和型號(hào)往往有很大的區(qū)別。對(duì)于沒有統(tǒng)一國標(biāo)規(guī)定的測(cè)定方法，在底物的性質(zhì)上存在許多不同，其中多以鹽的形式居多，例如纖維素酶的底物以用羧甲基纖維素鈉為多，但也有直接用微晶體纖維素進(jìn)行測(cè)定的方法。即便是植酸酶的底物植酸鈉也存在不同種型號(hào)的情況，應(yīng)用不同型號(hào)的植酸鈉進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果之間差別也很顯著。我們采用試驗(yàn)的方式考察了不同pH條件下二種底物(SigmaP8810和P3168)檢測(cè)不同酶活水平的植酸酶時(shí)其檢測(cè)值之間的差別。結(jié)果表明：不同pH條件下，P8810與P3168的檢測(cè)結(jié)果之間差異都極顯著(見表1)。
　　表1 不同pH下三種底物對(duì)不同酶活水平的植酸酶檢測(cè)結(jié)果及分析

pH
底物

酶活水平(U/g)
　　1000 3000 5000 6000 7000 10000
　　5.5 P8810 1617±25 4158±10 5980±4 7670±141 10040±119 12795±100
　　P3168 1340±15 3181±77 5014±17 5903±50 8009±59 9790±150
　　5.0 P8810 1748±36 5384±53 6738±33 8559±101 10890±118 14508±130
　　P3168 1596±72 4508±26 6113±65 7498±43 9802±132 12621±227
　　因素 P值
　　底物 P3168(5.5,5.0) P8810(5.5,5.0) P=0.000
　　3. 顯色劑的配置
　　酶制劑檢測(cè)時(shí)其量的判斷一般都是通過試劑顯色來確定，并用不同的方式對(duì)比產(chǎn)物生成的量。顯色劑里同時(shí)配有使反應(yīng)中止的試劑，使整個(gè)溶液起到顯色和中止的作用，一般顯色液的配置都比較復(fù)雜，例如植酸酶顯色劑釩鉬酸胺溶液、測(cè)定還原糖類用的顯色劑DNS(3,5-二硝基水楊酸)溶液等。其中，顯色劑類型的不同、相同顯色劑但其中物質(zhì)配比的不同、顯色劑在反應(yīng)中添加量的不同以及顯色時(shí)間的不同，都會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)結(jié)果，對(duì)酶活檢測(cè)的值也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。聶國興(2002)研究了DNS量對(duì)木聚糖酶活性測(cè)定的影響，結(jié)果表明：由于DNS用量變化，測(cè)定結(jié)果也發(fā)生了明顯變化，DNS用量在3ml時(shí)測(cè)得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法測(cè)定纖維素酶活力最適條件，結(jié)果表明DNS顯色5分鐘比較適宜。DNS溶液的配置以3,5-二硝基水楊酸試劑為主，加入氫氧化鈉保持DNS的堿性環(huán)境并中止酶解反應(yīng)，同時(shí)加入防止溶解氧侵入的酒石酸鉀鈉，還可能加入一些顏色穩(wěn)定劑如亞硫酸鈉、苯酚等。我們應(yīng)用試驗(yàn)研究了添加和不添加試劑亞硫酸鈉、苯酚的DNS前后對(duì)比對(duì)酶活產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明添加與不添加對(duì)比色的吸光值產(chǎn)生顯著影響，對(duì)酶活和穩(wěn)定性影響不顯著。試驗(yàn)研究DNS顯色時(shí)間不同和DNS添加量不同時(shí)木聚糖酶酶活變化趨勢(shì)，結(jié)果表明DNS顯色時(shí)間在5min添加量在3ml時(shí)最合適(見下圖1)。
　　圖1 DNS顯色時(shí)間不同和DNS添加量不同時(shí)木聚糖酶酶活變化趨勢(shì)
　　4 稀釋倍數(shù)
　　目前測(cè)定酶活的方法通常是先把酶稀釋，然后測(cè)定稀釋酶的活力，所得到的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為原酶的活力。但是，事實(shí)上許多酶的活力和稀釋倍數(shù)并不成比例關(guān)系。選擇酶樣的稀釋倍數(shù)實(shí)質(zhì)上是選擇酶分子與底物分子之間的數(shù)量比例，二者的比例只有在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)時(shí)酶蛋白的活力才與產(chǎn)物的生成量呈線性正比例關(guān)系。酶樣稀釋倍數(shù)過大會(huì)影響酶活的穩(wěn)定性，稀釋倍數(shù)不同最終獲得的酶活測(cè)定值有很大差異。費(fèi)笛波等(2004)為探討稀釋率對(duì)木聚糖酶測(cè)定結(jié)果的影響，將酶樣稀釋度從1000倍升至11000倍，結(jié)果表明，稀釋度的改變，明顯影響酶活力測(cè)定結(jié)果，稀釋度低，因吸光值太大使結(jié)果大大偏低;但稀釋度過大因A值過小，結(jié)果也偏低。筆者根據(jù)平時(shí)大量酶活測(cè)定應(yīng)用性研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果僅僅以吸光值的合理范圍(一般以0.2～0.5為宜)為稀釋依據(jù)，那么當(dāng)稱取樣品的質(zhì)量不同時(shí)，其測(cè)定的酶活值之間相差也非常大。所以，要想獲得相對(duì)穩(wěn)定的測(cè)定結(jié)果，必須從合理吸光值范圍、最終稀釋液的濃度及稱樣量多方面考慮。
　　5 曲線的制作
　　標(biāo)準(zhǔn)曲線是酶制劑檢測(cè)過程中能求出檢測(cè)值的唯一對(duì)照依據(jù)，曲線方程的大小直接影響著換算出來的測(cè)定值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，要使得到方程的截距盡量小，R平方值盡量趨近于1，這樣才能更好的減小曲線的誤差對(duì)測(cè)定酶活值產(chǎn)生的影響。為了減少系統(tǒng)誤差給測(cè)定帶來的影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)應(yīng)盡可能和樣品在同一條件下反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品的選擇應(yīng)盡量用純度較高的基準(zhǔn)物或分析純品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)注意保存防止吸水而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作一般可以采用相對(duì)法和絕對(duì)法兩種形式，相對(duì)法是借助已知準(zhǔn)確含量的酶標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對(duì)法則是用一些酶活定義中規(guī)定的反應(yīng)產(chǎn)物來衡量酶解產(chǎn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對(duì)法適用于法定的質(zhì)量認(rèn)證及仲裁機(jī)構(gòu)，相對(duì)法適用于一般有日常測(cè)定需要的機(jī)構(gòu)或企業(yè)。
　　6 小結(jié)
　　酶活測(cè)定是一種非常細(xì)致的工作，飼用酶制劑的檢測(cè)不僅是飼用酶推廣和應(yīng)用的瓶頸技術(shù)之一，也是檢驗(yàn)酶制劑產(chǎn)品的主要手段。在酶活檢測(cè)的過程中，不但要注意酶活定義中規(guī)定了的一些主要影響因素，很多非定義因素對(duì)酶制劑檢測(cè)也會(huì)產(chǎn)生很大的影響。同時(shí)檢測(cè)時(shí)的一些操作細(xì)節(jié)問題也應(yīng)該注意，比如：離心速度、搖勻力度和次數(shù)、攪拌時(shí)間、移液器的正確使用以及玻璃儀器的清潔度等，這些細(xì)節(jié)可能不是酶制劑研究工作者非常關(guān)注和研究的焦點(diǎn)，但對(duì)于一些性質(zhì)不穩(wěn)定的酶制劑，這些細(xì)節(jié)問題的疏忽也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。所以，酶制劑檢測(cè)過程中應(yīng)盡量把每一個(gè)要點(diǎn)和步驟做好。
　　參考文獻(xiàn)
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