飼料活性賴氨酸的幾種測定方法

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　　飼料活性賴氨酸的幾種測定方法[1]

　　鄧敦  謝冰梅 唐時花  鄧躍林

　

　　賴氨酸(lysine, Lys)作為豬的第一限制性氨基酸，從20世紀50年代開始一直是動物營養學研究的熱點之一。Lys在動物飼料中用量大、成本較高，因此必須精確地確定動物最佳生長發育的最低需要量。另一方面許多原料經過加熱、加壓、磨粉、堿處理或貯存時間過長，均可導致Lys的є-氨基與其它物質發生反應，形成脫氧酮糖化合物，該物質雖能被動物吸收，但無營養價值(Eichner 等, 1994)，從而導致部分Lys不能被動物利用。只有準確評價Lys的有效率，才能合理利用Lys，從而避免蛋白質資源的缺乏和浪費，減少動物對氮的排放和環境污染。準確測定飼料和回腸末端食糜活性Lys含量，將有利于動物對Lys需要量的研究。
　　1 活性Lys(Reactive lysine)的定義
　　Lys的基本結構為丙胺酸(如圖1)，丙胺酸的β-碳原子上帶有一個丙胺基，ε-氨基比α-氨基具有較高的pKa(多肽為10.5)，從而使得Lys側鏈的親核性下降。特殊環境作用能夠降低Lys側鏈的pKa，使之變得活躍。活性Lys是指Lys上的є-氨基能與其他物質發生反應的Lys，可利用Lys是指食入的Lys能夠被動物吸收并可用于蛋白質合成的Lys，可消化氨基酸是指食入的Lys經消化后被吸收的Lys，從實用角度，可以把可消化Lys和可利用Lys同等對待，但活性Lys與可消化Lys或可利用Lys有著本質的區別。
　　圖1 賴氨酸的基本結構
　　2 活性Lys的測定方法
　　飼料活性Lys的測定方法有多種，每一種方法都有各自的優缺點，許多研究者對各種方法分別進行了論述(見表1)。
　　2.1 1-F-2，4-二硝基苯法(FDNB法)
　　Carpenter(1960)用FDNB法連接Lys殘基，酸水解之后用分光光度計測定DNP-Lys含量，當樣品含有碳水化合物時，會生成一些不穩定的化合物，導致過高估計活性Lys含量(Matheson，1968)。Holm(1971)在碳水化合物水解時，試圖使用色譜法從受到干涉的氨基酸和其他化合物中分離出DNP-Lys。Peterson和Warthesen(1979]使用高效液相色譜來分析活性Lys，檢測波長為436 nm，C18毛細柱，20%乙氰和80% 0.01M醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)作為流動相，該法首先應用在分析二硝基苯基化棉籽蛋白的水解產物。Catherine等(1997)[11]應用上述方法未能很好地測定DNP-Lys，并得出DNP-Lys紫外線最大吸收峰在364 nm，而不是在436 nm，并對此分析方法做了改進，用20%乙氰和80%0.01M鄰苯二甲酸氫鉀緩沖劑(pH3.9)混合物作為流動相，在此條件下，DNP-Lys和其它化合物能很好地得到分離。Qin等(1998)報道，用FDNB法測定中國大豆和阿根廷大豆活性Lys，加熱到100℃和118 ℃時，FDNB-活性Lys變化規律不明顯，但當加熱到136℃，兩種大豆中活性Lys含量隨加熱時間的延長而降低。近年來，很多學者用高效液相色譜法測定以谷物為主的嬰兒食物、嬰兒配方食品和其他食品DNP-Lys含量，但是沒有進一步與動物試驗結果進行比較(castillo等，1997;Alala-Hurtado等，1999;Fernandez-Artigas等1999;Hermandez等，2001)。
　　表1飼料原料活性賴氨酸的測定方法

方法	出處
1-F-2，4-二硝基苯法（FDNB）	Carpenter，1960
胍基反應法 (Guanidination)	Mauron 和 Bujard，1964
O-鄰苯二甲醛(OPA)	Goodno等，1981
化學計量染色法	Ibolya 和Margit，1985

　　2.2 胍基反應法 (Guanidination)
　　胍基反應法是Mauron和Bujard(1964)建立一種活性Lys分析方法，這種方法根據ε-氨基在堿性條件下與鄰-甲基脲胍基反應形成同型精氨酸，經過水解后同型精氨酸可以用離子交換層析法測定，該測定方法盡管反應時間較長(幾天)、溫度控制嚴格(室溫)，但分析結果可靠，因此現在還普遍使用。Mao等(1993)用葡萄糖或堿處理大豆活性Lys，結果表明，與總Lys分析比較，葡萄糖處理組總Lys含量下降17%~40%，活性Lys含量下降78%~85%。用胍基反應證實了熱堿處理損害活性Lys更為真實, 其原因是在酸水解時重新除去一些被反應的Lys(如美拉德反應起始物果糖-Lys)。Imbeah 等(1996)在酪蛋白和大豆粉中得到胍基反應的最佳反應條件，得到可溶奶蛋白Lys轉化率為100%，大豆稍低于80%。 Ravindran(1996)等研究了飼料原料胍基反應，以確定內源氨基酸的分泌量，主要集中棉籽蛋白最佳轉化的研究，64% Lys轉化為同型精氨酸。Moughan(1996) 在上述相同的試驗條件下，用胍基反應法與FDNB法測定了熱處理酪蛋白/乳糖混合物中活性Lys含量;Rutherfurd(1997 a)用胍基反應法和FDNB法對血粉、小麥粉、肉骨粉、豆粉、棉子粉活性Lys含量進行比較。兩者結果表明，胍基反應法測出活性Lys含量等于或高于用FDNB法(見表2)。因此，Rutherfurd(1997a, b)、Moughan(1996)指出該方法在消化試驗中能更加精確地確定Lys消化率，因為在分析粗原料和食糜Lys時，沒有減去蛋白質水解前所破壞的Lys。從表3可見，在血粉、豆粉、肉骨粉、干燥玉米、熱脫脂乳粉以及棉籽粕中，常規氨基酸分析法測定回腸真消化率明顯低于可消化Lys含量。
　　表2胍基反應法和FDNB法測定蛋白質原料活性賴氨酸含量的比較

飼料原料	FDNB法	胍基反應法
血粉	84.4	88.0
小麥粉	3.1	3.1
肉骨粉	30.4	34.6
豆粉	27.1	32.3
棉子粉	14.7	14.4

　　2.3 熒光計分析法(OPA法)
　　Goodno等 (1981)設計了一種熒光計分析法，用鄰苯二甲醛(OPA)來估價蛋白質活性Lys。Vigo等(1992報道美拉德反應前后，不同富含碳水化合物奶產品，其活性Lys含量可用OPA分光光度計法進行測定(表4)，從FDNB法測得的數據可以看出，透析前活性Lys明顯低于透析后，無透析樣品損失了活性Lys，可能是由于糖含量較高。當有糖存在時，FDNB法測量活性Lys會過低。從OPA法測得的結果來看，透析與不透析的差異不明顯。所以在有高水平糖存在時，用OPA法分析飼料或食物活性Lys應該是可行的。
　　表3幾種飼料原料中“常規”回腸真消化賴氨酸與可消化“活性”賴氨酸的比較

飼料原料	賴氨酸消化率		標準誤
	“常規”	可反應
血粉	96.3	96.7	0.41NS
小麥	92.6	92.1	0.45NS
肉骨粉	88.9	91.5	0.76NS
豆粕	94.5	96.5	0.41※
干燥玉米	80.5	84.3	1.54※
熱脫脂乳粉	69.1	94.0	1.11※※※
棉籽粕	62.1	71.9	1.75※※

　　NS表示差異顯著;※, P<0.01; ※※, P<0.05; ※※※, P<0.001(Rutherfurd 等，1997)。
　　表4 相同模式下OPA法和FDNB法測出透析和未透析奶制品賴氨酸值

	未透析樣品			透析樣品
	OPA	FDNB		OPA	FDNB
樣品1	8.2±0.16	7.3±0.09		8.2±0.10	8.4±0.12
樣品2	7.0±0.21	6.5±0.15		7.1±0.15	7.1±0.08
樣品3	6.2±0.17	5.0±0.09		6.3±0.18	6. 1±0.05
樣品4	4.6±0.11	4.0±0.04		4.5±0.03	4.6±0.03
巴氏法滅菌牛奶	8.9±0.19	6.9±0. 04		8.8±0.19	8.5±0.16
牛奶粉	8.0±0.09	6.5±0.07		8.0±0.1 5	7.7±0.04
濃縮甜牛奶粉	7.4±0.12	6.4±0.13		7.3 ±0.18	7.1±0.05

　　※樣品1 未加熱, 樣品2 60°C加熱20小時, 樣品3 100°C加熱1小時, 樣品4 120°C加熱45分鐘; 表中數據為平均±標準差。
　　與其它化學方法比較，用OPA法估計奶產品活性Lys有以下幾個優點：1)糖不會干涉;2)分析樣品量少;3)操作簡單;4)沒有嚴格的處理，如蛋白質水解、加熱或溶劑萃取，可以在短時間內完成。
　　2.4 化學計量染色法
　　Ibolya和Margit (1985)使用化學計量染色法確定大豆蛋白活性Lys含量，根據蛋白質自由堿性基團與1-苯-2萘酚-6, 8二磺酸(OG)反應來確定。蛋白質游離的部分堿性基團(組氨酸、精氨酸和Lys)來確定總氮含量，部分堿性基團通過美拉德反應來確定總氮變化。根據兩個分子結構不同而作出的假設，OG顏色敏感性只有AO-12(十二烷基二甲基氧化銨)的一半。因為OG含氮載體能夠結合兩個氨基，而AO-12只能結合一個氨基。染料與蛋白質比通常小于1， AO-12測定活性Lys是直接根據它的染色能力。
　　染色法是測量蛋白質熱反應最方便的方法，具有便宜、省時省力、不需要水解蛋白質等優點。3 小結
　　FDNB法、胍基反應法、熒光計分析法和化學計量染色法四種方法各有優缺點。在實際生產中，為了檢測活性Lys的結果更加準確，應根據不同飼料原料選擇不同的方法。通過測定飼料和回腸食糜活性Lys含量，我們能夠精確估計飼料成本，更有效地選擇飼料原料，從而為配制高效日糧提供理論依據，進一步改善日糧蛋白質的利用效率，為節約蛋白質資源開辟新的道路。
　　參考文獻
　　1 Swaisgood, HE and Catignani, GL. Digestibility of modified milk proteins: nutritional implications. J. Dairy Sci. 1985, 68, 2782-90.
　　2 Carpenter, KJ.. The estimation of the available lysine in animal protein foods. J. Biochem. 1960, 77, 604-10.
　

quickl

一直要找的資料。。。收藏了。謝謝樓主

jstcxzh

沒看明白，測活性賴氨酸的作用和實際指導意義。謝謝!