飼料原料、飼料中霉菌毒素快速檢測新技術研究與應用

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摘要：本文通過對當前霉菌毒素污染現狀的展現以及對傳統霉菌毒素檢測技術的對比分析，著重提出了霉菌毒素檢測技術的重要性和實際應用存在的問題，也直接指出了生產一線對于霉菌毒素檢測技術的迫切需求，通過對傳統檢測技術中的免疫方法的分析和論證，在充分結合生產實際以及對于霉菌毒素問題解決要求的基礎上，充分吸收了現有檢測技術優點，開發了新型金標抗體快速檢測試紙條，徹底解決生產單位對于各種原材料霉菌污染情況滯后控制的被動局面的實際問題，對整個飼料養殖行業乃至食品行業的產品安全保障起到了強化作用，對進一步提高飼料轉化率和養殖經濟效益具有重大促進作用。于此同時，就當前在飼料養殖領域普遍推廣的霉菌毒素吸附劑使用技術也進行了科學的分析，為這些成品的應用提供了可靠性依據。文章同時還為其他快速檢測技術的研發提供了參考思路。
關鍵詞：飼料原料  霉菌毒素  危害  快速檢測  金標抗體  試紙  現場
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趙曉慶

飼料原料、飼料中霉菌毒素快速檢測新技術研究與應用
徐   超
上海澳靈生物科技有限公司
摘要：本文通過對當前霉菌毒素污染現狀的展現以及對傳統霉菌毒素檢測技術的對比分析，著重提出了霉菌毒素檢測技術的重要性和實際應用存在的問題，也直接指出了生產一線對于霉菌毒素檢測技術的迫切需求，通過對傳統檢測技術中的免疫方法的分析和論證，在充分結合生產實際以及對于霉菌毒素問題解決要求的基礎上，充分吸收了現有檢測技術優點，開發了新型金標抗體快速檢測試紙條，徹底解決生產單位對于各種原材料霉菌污染情況滯后控制的被動局面的實際問題，對整個飼料養殖行業乃至食品行業的產品安全保障起到了強化作用，對進一步提高飼料轉化率和養殖經濟效益具有重大促進作用。于此同時，就當前在飼料養殖領域普遍推廣的霉菌毒素吸附劑使用技術也進行了科學的分析，為這些成品的應用提供了可靠性依據。文章同時還為其他快速檢測技術的研發提供了參考思路。
關鍵詞：飼料原料  霉菌毒素  危害  快速檢測  金標抗體  試紙  現場
眾所周知，在各種農產品上生長著各種各樣的霉菌，這些霉菌在一定的環境條件刺激下，都能產生霉菌毒素，霉菌毒素是一類有毒的化合物，有些甚至是致癌的（如黃曲霉毒素）。霉菌毒素有很多種（CAST,2003），包括黃曲霉毒素，主要是黃曲霉毒素B1和M1（Aflatoxins，FB1、FM1）；赭（棕）曲霉毒素A（OchratoxinA，OA）；雜色（柄）曲霉毒素（Terigmatocystin）；展青霉素（Patulin,PTL）；玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F－2)）;串珠鐮刀菌素（Moniliformin,MF），三硝基丙酸以及屬于單端孢霉烯族化合物（Trichothecenes）的T－2毒素（T－2toxin,T－2）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）（Deoxynivalenol,DON）；二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（Diacetoxyscirpenol，DAS）等。
聯合國糧農組織也在近期的報道中指出，為了保障人類的健康，全世界至少99個國家，占世界人口的87％，針對糧食和飼料的霉菌毒素污染問題都有相關的規定，有些規定限量還非常苛刻。在未來的幾年里，不斷變化的全球氣候突發事件的增多將進一步向我們提出挑戰。霉菌毒素污染給糧食生產者、 家禽生產者以及食品和飼料的加工企業造成了巨大的經濟損失。中國的霉菌毒素污染問題也不例外，根據中國農業大學計成教授等多年來的的調查結果顯示，中國境內的霉菌毒素污染問題相當嚴重，根據污染程度的輕重，將中國劃分為四個區域（見下圖1）。
圖1  中國區域內霉菌毒素污染現狀分布圖
備注：B1區域為輕污染區；B2為一般污染區；B3是中度污染區；B4是超重度污染區。
從上圖分布情況可以看出，一向認為是沒有霉菌毒素污染地區的北方大部分地區，同樣被霉菌污染所包圍，因此，霉菌毒素的廣泛存在以及霉菌毒素對我們身體健康的影響已經引起了各級政府的高度關注，隨之一系列有關食品安全、飼料安全的法規和制度也先后出臺了，而且大多數為強制性執行標準。同時也因為越來越多的養殖企業開始大量使用霉菌毒素吸附劑，飼料企業也開始密切關注霉菌毒素吸附劑的使用情況，但是在使用的過程中，一直存在著一些疑問：是不是每批原料都需要使用脫毒技術？是不是每批原料的毒素吸附劑使用劑量都相等？諸如此類疑惑藏在從業人員心間，于是有些客戶就不斷尋找一種可以在使用吸附劑前快速檢測原料中霉菌毒素污染程度的技術，只有這樣才可以為飼料中添加霉菌毒素吸附劑提供現場的直接的原始依據。所以研究并開發飼料原料以及飼料中霉菌毒素污染程度的快速檢測技術已經成為一個市場的迫切需求了。
一、飼料霉變對畜牧業的危害
霉菌毒素污染的飼料對動物生產性能帶來的負面影響有些是察覺不到的， 有些卻是破壞性的。世界范圍內，養殖業每年因霉菌毒素對飼料的污染造成的經濟損失就有幾百億美元。如黃曲霉毒素污染造成經濟損失包括它能使動物生長受阻、 飼料適口性降低、食欲減退、飼料轉化效率下降、死亡率增加、降低繁殖性能、蛋雞產蛋量減少、 肉雞腿病和胴體污染、內臟出血、肝臟受損、胚胎中毒和對環境應激和病原微生物的抵抗力下降等等。肉雞黃曲霉毒素中毒后，血液中總蛋白、 膽固醇和血液尿素氮的含量減少。還發現黃曲霉毒素影響維生素D的代謝，造成骨骼強度下降，腿軟弱無力。另外黃曲霉毒素還影響幾種礦物元素的代謝，如鐵（引起溶血性貧血）、 磷（引起腿軟弱無力）。
霉菌毒素主要通過影響細胞和體液免疫功能來降低動物機體的抵抗力。大量研究表明，黃曲霉毒素引起肉雞的免疫功能抑制進而增加對疾病的易感性，飼以蛋雞50～200μg/kg黃曲霉毒素的日糧，其產蛋率和孵化率顯著降低；對肉雞的研究表明，日糧中100～200μg/kg的黃曲霉毒素可顯著降低嗉囊重量，對肉雞免疫功能產生不良影響。當實驗動物接觸單端孢霉毒素后，會導致其對傳染病的易感性。黃曲霉毒素對免疫系統的影響有如下幾方面：法氏囊和胸腺的體積變小；Ｔ淋巴細胞、Ｂ淋巴細胞和白細胞的數量減少；血清總蛋白和免疫球蛋白水平降低；抗體滴度下降；血清中抗生素濃度下降等。單端孢霉毒素也可影響抗體的產生，這使得機體反應在免疫程序中減弱。同樣赭曲霉毒素A對免疫功能有抑制作用，這和赭曲霉毒素的致癌作用有直接的聯系。
霉菌及其次級代謝產物（主要是霉菌毒素）在動物性食品中殘留可通過食物鏈而對人類健康構成潛在危害。例如黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素B1在哺乳動物體內的主要代謝產物。存在于動物的乳汁、肝、蛋類等可食部分，常見于乳汁中，它有很強的毒性和致癌性。由于乳及乳制品是嬰幼兒的主食，而嬰幼兒的解毒功能器官發育不完善，因此黃曲霉毒素M1對嬰幼兒健康有直接的威脅，在實際生產中，嚴格控制奶牛飼料中黃曲霉毒素B1的含量對保障奶及奶制品安全具有直接的現實意義。同樣赭曲霉毒素A在動物產品中的殘留問題也應引起高度重視，Krogh等證實該毒素可在腎、肝和肌肉中殘留（見下表1、表2）。
從表1可以看出，我們人類的許多重癥和不治之癥都和霉菌毒素的污染密切相關，要攻克疾病治愈難題，首先要攻克霉菌毒素污染的治理難關。
從表2可以看出，盡管霉菌毒素污染很嚴重，其對于動物的健康危害非常可怕，但是對于不同的動物來說，不同的霉菌毒素對其的影響是有差異的。而事實上同一種霉菌毒素對于動物的不同生長階段，其影響也是不同的，一般而言幼小動物對于霉菌毒素的敏感度要高于成年動物。
另外，由于絕大多數霉菌毒素中毒的動物表現癥狀都不是急性發作的，而是逐漸積累到一定程度突破動物自身的耐受限度后才表現出來，因此霉菌毒素的危害有很強的隱蔽性，加上各種霉菌毒素之間存在著協同疊加效應（如表3列舉），因此，當飼料中存在多種霉菌毒素時，其毒害效應往往比單一毒素的危害要增強數倍乃至數十倍。
表1 已經被確認的疾病的元兇

表2  霉菌毒素對動物的危害

表3  霉菌毒素之間的協同效應

綜上所述，生產單位技術人員只有掌握了飼料中的主要霉菌毒素污染程度（根據不同動物敏感度確定主要毒素種類），才能夠科學的制定解決方案，合理的把霉菌毒素危害降到最低。所以對飼料原料和飼料本身開展毒素檢測至關重要。
二、飼料中霉菌毒素的定性與定量檢測技術
目前已經被大家所熟悉并接納的檢測技術主要有以下幾種：
一類是生物學檢測法, 包括種子發芽試驗、嘔吐試驗等，但是檢測結果的時效性很差，在實際生產中已很少采用；另一類是理化檢測法, 薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC雖然簡便，但靈敏度差； HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復雜，儀器昂貴，標準品耗用大。還有一類是利用免疫化學原理開展的實驗室快速檢測法，如ELISA方法---即酶聯免疫法。
2.1目測法
當出現畜禽拒食，飼料和谷物發熱，有輕度異，色澤變暗，飼料結塊等跡象時應考慮飼料可能霉變。因霉菌都是從霉菌孢子或是菌絲體碎片開始生長的，霉菌生長時消耗了養分，代謝中有能量釋放，故而使飼料變色、變味、發熱。
菌絲體可與飼料縱橫交織，形成菌絲蛛網狀物，這些結構使得飼料結塊。在我們肉眼所能夠觀察到這些菌絲網狀物以前，菌絲體已經在大范圍內生長繁殖。因此，飼料結塊是診斷飼料霉變的最簡易實用的方法之一。
不同的霉菌菌落各有其特征，通過顯微鏡觀察可進一步檢測確認。
另外飼料養殖企業經常采用的計數統計方法也屬于此類（在1000粒玉米顆粒中檢出多少粒發霉的顆粒，控制標準為低于2%），但是這種方法一般只是直觀檢測有霉菌的情況，并不能對于隱含其內部肉眼看不見的霉菌毒素給出精確判定，實際上并不可靠，因為霉菌和霉菌毒素是兩個不同的概念。
2.1.1　曲霉屬　
本屬菌的菌落顏色多樣，而且比較穩定，是分類的主要特征之一。曲霉菌落表面一般呈絨毛狀，起初為白色或灰白色，長出孢子后則顯現出不同的顏色，隨菌種而異。如黃曲霉毒素產毒菌株長出黃綠色分生孢子，此時將培養皿置于365 nm紫外燈下，菌絲體出現亮紫色熒光。寄生曲霉由致密的基層菌絲組成，具有較寬、白色、幾乎不形成孢子的邊緣，前期呈明顯的淡黃色，以后呈草綠色，最后呈暗濁黃綠色,其小梗是純單層。雜色曲霉小梗嚴格雙層,分生孢子頭呈典型的放射狀，明顯的綠色，分生孢子梗無色或淺褐色。
2.1.2　青霉屬　
青霉的菌落大多呈灰綠色。菌落有絨狀、絮狀、繩狀和束狀4種類型。有的青霉菌菌落具有放射性皺褶，有的形成同心輪紋，有的在基質表面有滲出液。顯微鏡下觀察時可見到獨特的帚狀體結構。
2.1.3　鐮刀菌屬　
鐮刀菌菌落一般呈白色絨毛狀，常產生可溶性色素。分生孢子有大小2種類型，顯微鏡下大型分生孢子大多呈鐮刀形，多隔；小型分生孢子有卵形、梨形、圓形和柱形等。
2.2薄層層析法(TLC)
TLC法是我國測定食品及飼料中霉菌毒素的國家標準方法之一，其原理是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據熒光斑點的強弱與標準比較測定其最低含量。TLC法由于設備簡單，易于普及，所以國內外仍在使用，但該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質較多，在展開時影響斑點的熒光強度，而雙向展開雖避免了雜質干擾，但增加了操作步驟和時間(葉雪珠,2003)。此類方法和前面的目測法仍然偏重于定性檢測。
2.3色譜法(HPLC)
色譜法，包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的真菌毒素的化學分析方法。薄層色譜由于方法靈敏度和分離效率等問題，1985年以后便很少用了，然而，在發現確證新毒素、快速監測方法建立、毒素分析方法研究等方面，尤其是當實驗條件有限時，薄層色譜依然有其優越性；氣相色譜，包括氣相色譜-質譜聯用技術，更多的是用在單端孢霉烯族毒素的分析上；現在比較普遍的真菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質譜聯用技術，在方法適用性、分離效率和靈敏度方面，液相色譜法及液相色譜-質譜聯用技術都是其他方法所無法替代的。近年來，毛細管電泳及毛細管電泳-質譜聯用技術以其高分離效率也開始應用在真菌毒素分析領域并引起了廣泛關注。
總之，HPLC法是近幾年發展起來的檢測霉菌毒素方法，主要是用熒光檢測器檢測，在適宜的流動相條件下，采用反相C18柱，使霉菌毒素同時分離。該法快速而準確，純化效果好，最低檢出量0.08ng，回收率為92.87%，但需要昂貴的儀器設備，一般僅限于專業檢測機構獲得科研和調查分析、監測使用，未能在企業廣泛推廣使用，而且其結果的滯后效應大大降低了對生產實際的指導效果。
2.4免疫化學檢測法
免疫學檢測方法是基于抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法，該方法橫跨細胞免疫學學科、分子免疫學學科、生理生化學科等諸多學科領域，是一種多學科交叉后產生的新技術。由于免疫反應的特異性特點，此種方法具有較高的選擇性和很低的檢出限，廣泛用于各種抗原、半抗或抗體的測定，一般可分為熒光免疫法、發光免疫法、免疫法及電化學免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在飼料霉菌毒素檢測中應用較廣的主要是酶聯免疫吸附法（ELISA），也可以稱作是實驗室快速檢測法，1977年美國Lawell 等首先建立了ELISA競爭法檢測AFB1 。隨后美國學者朱繁生教授、英國學者Morgan 教授分別改進了該法。我國李秀芳和俞順章教授分別于1987年與90 年代建立了ELISA 法檢測AFB1 ，成恒嵩教授等起草了飼料中AFB1 的ELISA檢測方法國家標準，并于1998 年由國家質量技術監督局正式批準頒布實施。
ELISA 法特別適宜大批樣品的集中檢測，相對于單個飼料企業來說，本方法在實際應用上存在著明顯的缺陷。目前有較多的集團性農牧企業在集團總部檢測中心建立了ELISA檢測實驗室，也有個別飼料企業購置了酶標儀開展檢測，但是無論是集團性檢測還是單個飼料企業開展檢測，都由于收到檢測樣品數量的限制以及送檢集團總部的時間限制性和檢測成本等因素，仍然不能滿足生產一線的現場快速檢測的需求。
總體來說，免疫學檢測方法由于其快速、靈敏、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高等特性，特別適用于飼料廠進行原料或成品的檢測。其基本原理是在合適的載體上，酶標記抗體或抗原與相應的抗原或抗體形成酶標記的抗原抗體復合物，在酶底物參與下，復合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成為另一種帶色物的抗原和抗體的含量。該免疫學方法更實際，其靈敏度與TLC或HPLC法相當，因而具有更廣闊的應用前景。
該類方法有以下特點：1) 靈敏度高：免疫層析法檢出量可達ng級，ELISA 法最低檢出量可達pg級，并可定量測定。2) 干擾小：抗體抗原的免疫反應特異性很強，結構類似物、熒光物質、有色物質對檢測的干擾很小。3) 操作簡便快捷：由于特異性強，簡化了樣品的預處理和提取純化過程，同時操作步驟也非常簡便，測定時間也短。4) 安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂貴的測定儀器，所用試劑也相對較少，特別是因為靈敏度高，毒素標準品的濃度可以很低，減少了對檢測人員和環境的潛在危害和污染。
三、國內幾種真菌毒素檢測方法的研究進展
3.1 黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物。即含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。前者為基本毒性結構，后者與致癌有關。國內最早研究真菌毒素免疫檢測方法的是中國醫學科學院腫瘤研究所的孫宗棠，他于1983年建立了AFB1單克隆抗體放射免疫測定方法。1992年，中國科學院上海細胞所李永鏞和上海醫科大學公共衛生學院殷芬、俞順章等人合作建立了AFB1單克隆抗體的酶聯免疫檢測方法。中國預防醫科院營養與食品衛生研究所和江蘇微生物所也先后建立了AFB1多克隆抗體的酶聯免疫測定方法。北京市營養源研究所路戈與中國醫科院腫瘤研究所王德斌和衛生部食品衛生監督檢驗所計融等人合作于1994年建立了規范的AFB1單克隆抗體酶聯免疫檢測方法，該法已列為國家標準（GB/T5009.22－1996）。在1985年以前，另有幾種熒光色譜法列為國家標準（GB/T5009.23－1996;GB/T5009.24－1996）。其中薄層色譜法由衛生研究所和青島商品檢驗局于1973年建立（GB/T5009.22－1996）。
3.2 T－2毒素為劇毒（豬靜注LD50=1.2mg/kg），具有明顯的細胞毒，而且是體內蛋白質合成的抑制劑，有致畸性和致突變性。中毒后嘔吐，腹瀉，嚴重時損傷造血組織。T－2毒素的免疫檢測方法由衛生部食檢所陽傳和、羅雪云、計融于1991年建立（GB/T14933－94），方法最低檢出量為1ng/ml，敏感范圍為4－1000ng/ml。這是首次采用免疫技術建立的檢測真菌毒素的國家標準。
3.3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素，DON）是較早（1970年）被分離提純后命名的真菌毒素，毒性弱于T－2毒素，（小鼠經口LD50=9.2mg/kg）中毒癥狀類似，有明顯的致吐作用。DON經對甲基苯甲醛噴霧后呈黃色，衛生部食檢所魏潤蘊于1986年建立了DON薄層層析檢測方法（GB/T14929.5－1994）。DON免疫檢測方法由衛生部食檢所陽傳和、計融于1992年建立，方法最低檢出量為5ng/ml，敏感范圍為5－1000ng/ml，該法已批準為國家標準（GB/T14929.5－1994）。小麥、面粉、玉米及玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標準已于1996年9月1日頒布實施（GB16329－1996），最高允許量為1000μg/kg
3.4二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇（DAS）的毒性強于T－2毒素（豬靜注LD50=0.367mg/kg），1992年，衛生部食檢所李業鵬、羅雪云等用酶標記單克隆抗體建立了檢測DAS的雙抗夾心酶免疫斑點檢驗方法，最低檢出量為10ng/ml，敏感范圍為2－1000ng/ml。
3.5玉米赤霉烯酮（ZEN，F－2）是另外一種從赤霉病麥中分離出來的真菌毒素（化學名稱為6－（10－羥基－6－氧基碳烯基）－β－雷鎖酸－μ－內酯，分子量為318），主要污染小麥、大米、玉米、蕎麥等谷物，是一種生殖系統毒素，有強烈致畸作用。ZEN在波長為254nm短紫外光照射下發出蘭綠色熒光，衛生部食檢所羅雪云、胡霞于1992年建立ZEN薄層層析分析方法，最低檢出量為50μg/kg。1993年中國農科院蘭州獸醫所王景琳、張志東等建立了ZEN單克隆抗體酶聯免疫檢測方法，最低檢出量為0.3ng/ml。1995年，北京市營養源研究所路戈等也建立了ZEN單克隆抗體免疫檢測方法，最低檢出量為1ng/ml，敏感范圍5－1000ng/ml，該法已通過國家標準審查。
3.6 赭曲霉毒素A（OA）主要表現為很強的腎臟毒（大鼠經口LD50=20mg/kg）并有致畸性和致癌性，污染的谷物主要為麥類及玉米。在紫外光下赭曲霉毒素A呈綠色熒光，衛生部食檢所于1991年建立了OA薄層層析分析方法，已列入國家標準（GB13111－91）。1992年該所陽傳和、羅雪云等又建立了OA單克隆抗體免疫檢測方法，也已經被批準為國家標準。
3.7 黃曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1經動物代謝產生的衍生物，可以從內臟、尿和乳汁中測出。尿或乳汁中排出的AFM1的量約為攝入AFB1量的1％。AFM1的毒性（鴨雛經口LD50≈0.32mg/kg）僅次于AFB1，致癌性也相似。因此乳及乳制品中AFM1的污染控制是食品衛生工作的重要環節。我國規定牛乳中AFM1的含量不得超過0.5μg/kg，乳制品按實際含乳量折算(GB9676－88)。1980年衛生研究所胡文娟、韓玉蓮（AFM1在波長365nm紫外光照射下呈蘭紫色熒光）建立了檢測幾種主要動物性食品中AFM1的薄層層析法，最低檢出量為0.1～0.5μg/kg（GB/T5009.24－1996）。1992年中國預防醫科院營養與食品衛生研究所的劉興介等人利用美國威斯康星大學朱繁生教授提供的單克隆抗體應用ELISA直接競爭法測定了97份乳粉樣品中的AFM1含量。（陽性率84.5％，超標率39.2％，最高4.16ng/g）1996年，衛生部食檢所李燕俊、計融開始研究AFM1的免疫檢測技術，目前主要工作已經完成。
3.8雜色曲霉素（柄曲霉素，分子量324）是一種很強的肝及腎臟毒素。可導致膽管癌和肝癌，有致突變性，但對食品的污染頻率較低。雜色曲霉素經三氯化鋁噴霧后加熱，可在365nm波長紫外光下呈黃色熒光。衛生研究所建立的檢測雜色曲霉素的薄層色譜法已于1984年列為國家標準（GB/T5009.25－1996）。該法對大米、玉米、小麥的最低檢出量為25μg/kg，黃豆、花生為50μg/kg。
3.9展青霉素（PTL）有致癌性，也有致畸、致突變作用，在水果制品中的污染較為嚴重。1998年衛生研究所劉勇、胡文娟建立了蘋果、山楂制品中展青霉素的薄層掃描測定法。該法于1994年列為國家標準，同時還規定了展青霉素的限量衛生標準（GB14974－94）。1992年吳南建立了用高效液相色譜法測定展青霉素的方法，最低檢出量為2μg/kg。
3.10串珠鐮刀菌素（MF）屬劇毒物，有很強的心臟毒，中毒死亡后可見心肌壞死性病變，近年研究表明該毒素可能是克山病主因。串珠鐮刀菌廣泛污染糧食作物，其中對玉米的污染率較高。1984年，俞世榮、王玉華建立了串珠鐮刀菌素的薄層及高效液相色譜測定法。
四、對于飼料中現有霉菌毒素檢測技術的小結
因化學加工、人為添加而進入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被預防的；而以食品的天然組分形式存在的天然霉菌毒素則不易被識別，且由于潛在毒性大，從而會對消費者的健康造成更大的威脅。霉菌毒素是霉菌次級代謝產物，屬于化學污染物，對人和動物都會產生非常嚴重的危害。拿黃曲霉毒素來說，含有黃曲霉毒素的食品被人誤食后容易出現肝臟病變，甚至導致肝癌；所以，對飼料、食品等原料開展霉菌毒素檢測是非常迫切需要解決的問題。
事實上，越早進行霉菌毒素檢測就越容易將霉菌毒素產生的危害降到最低。如能從源頭就發現霉菌毒素，則便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的飼料給養殖業帶來危害，從而使企業包括食品安全蒙上陰影。實際操作中，如果在飼料原料采購環節就采用快速篩選的方法，查看飼料原料是否含有霉菌毒素，則可以使企業避免使用含霉菌毒素的原料生產飼料，或者在原料緊缺又必須生產的情況下，可以針對檢測結果采取有效的霉菌毒素處理技術，全面降低霉菌毒素的毒害性。而目前已有的無論是目測、TLC法或者HPLC法以及稱之為實驗室快速檢測的ELISA試劑盒方法，都不能夠實現對于單一飼料原料和飼料成品的快速霉菌毒素污染程度的檢測，不是由于樣品數少就是實際成本過高無法承受或者就是檢測結果所需要的時間太長等原因，導致了檢測應用嚴重受限，飼料利用、養殖經濟效益都受到明顯影響，更加嚴重的是由于長期沒有可控制的直接指導數據，大多數飼料在到達養殖場以前幾乎沒有采取任何霉菌毒素的防治措施，動物都處于慢性中毒的狀態中（根據2006、2007、2008及2009年度上半年的檢測數據表明，飼料及飼料原料中同時存在四種以上霉菌毒素污染狀態比率占到被抽檢樣品總數的49.1%（見圖2 檢測樣品中霉菌毒素污染情況比率），霉菌毒素污染已經是作為一種常態而存在，一旦積累到動物不能承受了則開始出現病癥，即使不發病，動物內臟中所積累的毒素含量也足可以通過食物鏈來影響到人類的健康，如牛奶中的黃曲霉毒素M1就是由飼料中的黃曲霉毒素B1經過生理代謝轉化而來，對牛奶的食用者來說危險極大。一線的生產部門非常需要一種能夠在現場就開展檢測且不受樣品數量的限制，成本又不太高，又能夠把握住霉菌毒素污染程度的先進實用的新檢測技術。

圖2  檢測樣品中霉菌毒素污染情況比率對比
因此，研制對霉菌毒素快速、高靈敏、高特異性的現場、廉價的可靠的檢測方法顯得尤為重要。高效液相色譜、質譜檢測法，可做出精確定性定量測定，運用恰當甚至可測到各組分的含量，它們靈敏度高、選擇性強，有極好的發展前景，但是樣品前處理要求嚴格，標準品純度有一定的要求，而且儀器昂貴，測試人員往往還要進行專門的培訓，因此成本較高。所以，僅適合大型企業或對檢測靈敏度要求較高的科研院校、檢測機構等單位使用。免疫學檢測方法尤其是酶聯免疫吸附法具有靈敏度高，干擾少，測定步驟簡便、快速，操作安全，設備投資少，測定結果準確可靠等特點，非常適合實驗室開展集中的樣品快速檢測，由于受到樣品數量、試劑盒特殊保存條件、毒素標準品供應以及酶標儀操作要求的限制，無論檢測結果的穩定性、可靠性和經濟性，均不能滿足進行現場快速檢測的需求。
五、適合于飼料養殖企業進行現場快速檢測霉菌毒素污染的新技術
在傳統檢測方法基礎之上，近年來發展了許多新的檢測方法，其中值得一提的是，最近建立的采用免疫學和分子免疫學原理，利用特異性抗體與抗原的反應原理，開發一種現場的霉菌毒素檢測技術大受歡迎，這就是目前比較熱門的金標試紙卡現場霉菌毒素快速檢測技術。霉菌毒素快速檢測試紙法應用于飼料原料檢測，可以快速得到結果，為飼料、養殖企業應對霉菌毒素潛在危害的處理提供事先的、直接的、相對合理的科學依據。當原料快檢呈陽性結果時表明樣品中毒素的殘留限量在檢測設限值以上，當原料快檢呈陰性結果時表明樣品中毒素的殘留限量在檢測設限值以下。目前此項技術的開發已經完全國產化，并擁有自主的知識產權。
5.1 霉菌毒素現場快速檢測新技術
5.1.1主要原理
利用特定的抗原抗體反應原理，采用實現包被的特異性抗體捕捉檢測對象中的對應霉菌毒素成分，進而通過觀察測試線和控制線的顯色反應來達到判定檢測對象中的霉菌毒素污染程度的目的。如下圖結構（圖3 金標試紙卡的組成結構圖）

圖3 金標試紙卡的組成結構圖
檢測反應過程如圖4、圖5

圖4樣品檢測陰性反應示意圖

圖5 樣品檢測陽性反應示意圖

圖6 陰性、陽性檢測試紙反應實物圖
5.1.2 快速檢測結果判定
該技術根據不同霉菌毒素的危害程度以及飼料原料和飼料中對各種動物耐受限度的國標要求，設定了不同的最低靈敏度值，就是說，只要滴入檢測液加液孔中的液體中被檢毒素的濃度超過的最低檢測靈敏度，則顯示陽性，反之則顯示陰性。根據這個道理，檢測人員可以在樣品前處理提取出毒素后，應用專配的毒素檢測稀釋液進行等倍數稀釋配置成最終的檢測液，繼而根據檢測結果推算出被檢樣品中毒素含量的基本范圍，從而對生產提供直接的指導意義。
5.2 幾種檢測方法的對比
作為一種新型的霉菌毒素快速檢測技術，國外和國內基本上達到了同步，而且技術水平相當，無明顯的差異，根據武漢糧食中心的驗證結果表明（見表4、表5），黃曲霉毒素檢測結果和實驗室檢測結果完全符合，赤霉烯酮的符合率也達到了94%以上，如果加上試紙法本身的誤差范圍，快速試紙檢測結果的準確性在95%以上是由保障的。其最重要的意義在于，對于一個生產型企業而非研究機構的而言，對于霉菌毒素污染的狀況啟示只需要知道一個相對準確的范圍就可以對生產提供直接的指導，根本不需要采用費時、費錢、費人的方法檢測出具體的含量。
除此之外，國產技術轉化產品在成本上擁有完全的優勢，與目前市售的試劑盒相比，具有快速、方便、便宜和現場性等特點，加上其成本只有進口同類產品的40%左右，完全可以替代進口產品。應該說該技術具有很強的實用性，具有較高的推廣價值。該技術的應用，必然能夠給我國飼料安全、食品安全增加一層強有力的保護層，為國家的經濟建設做貢獻。
表4  快速檢測技術與傳統方法的對比

表5  快速試紙與試劑盒對比

表6黃曲霉毒素B1測試結果比較

表7 玉米赤霉烯酮測試結果比較

六、新型霉菌毒素快速檢測技術在生產實際中的應用
為了更好的在生產實際中使用好這個快速檢測技術，真正實現用最經濟的檢測投入達到檢測目的，從而贏得在霉菌毒素污染問題解決中的空間與時間，各個生產單位技術人員需要從以下幾個方面來逐一規范，才能夠發揮快速檢測的作用。簡單的說就是一標二告三測四判五定六選六個步驟，簡要分述如下：
6.1一標---制定內控標準
根據企業自身生產產品的特點以及動物不同階段，參照國標限值和動物耐受限量指標，首先制定本企業內部的各類原料和成品中霉菌毒素含量的限值標準，即內控標準，這點非常重要，沒有標準品控人員將無法比判，如果本標準制定不合理，判斷的結果將和生產實際產生較大誤差，會對生產實際產生指導偏差，那么會大大降低快速檢測技術的價值。建議各個單位應該多搜集相關資料和標準，緊密結合自身的產品生產需要來制定。
6.2二告---告知供應商、采購、品控
    即將經過論證制定的霉菌毒素內控標準進行備案，并告知原料供應商、采購部、品控部，便于進行統一管理。標準出臺后要快速告知相關環節，尤其是企業內部的品控和采購人員，否則容易產生誤會和工作上的摩擦，不利于正常的工作開展。
6.3三測---依據標準檢測
檢測人員按照企業技術部擬定的內控標準進行快速檢測，并進行快速的判斷。只要擁有了標準，品控人員就可以利用本技術快速的測定結果。
6.4四判---根據檢測結果對照標準判定合格與否
根據檢測的結果并對照內控標準，快速判斷被檢對象是否符合安全控制標準。檢測過程中一定要嚴格按照操作有關要求并注意細節，確保結果的準確性。
6.5五定---制定解決應對方案
根據判定結果，參照原料的實際使用狀況和毒素吸附劑產品的功能特點，由品控部提出初步的解決方案，技術部進行最后的裁定。
6.6六選---選擇合適的脫毒產品
需要使用毒素吸附劑進行脫毒時，則根據技術部門制定的解決方案聯系合適的產品供應廠商，在生產飼料時添加使用。
七、小結
霉菌毒素的污染盡管已經非常嚴重，但是我們畢竟已經研究了多種應對的方法，只要能夠在使用含有霉菌毒素的原料之前快速得到污染數據或者污染程度的判斷，我們就可以采取有效的積極的應對措施，將霉菌毒素的危害降到更低，從而保障飼料、養殖的健康發展。從這點上說，金標抗體快速檢測試紙技術的及時推出，必然能夠為整個飼料養殖行業早日擺脫“霉毒”的困擾做出較大貢獻，對于飼料中其他物質含量的快速檢測技術研發也具有重要的啟發和參考作用。

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徐超   上海澳靈生物科技有限公司  技術總監   
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yaoyuyuan

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qdwelly

:tiaotiao:好資料，謝謝