腐殖酸鈉對大腸桿菌的抑制作用研究

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腐殖酸鈉是用化學方法從風化煤、褐煤、泥炭中提出的一種有機弱酸鹽，形狀是棕黑色的輕質粉末，易溶于水，呈弱堿性，水溶液呈醬油色膠體溶液，它具有較強的吸附力和絡合力，釋放初生態，從而對某些細菌的生長有抑制作用（宦海霞等，２０１０）。眾所周知，大腸桿菌是寄居在人和溫血動物腸道中的正常菌群之一，少數具有致病性（韓立新等，２０１２）。大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一種以敗血癥和劇烈腹瀉為特征的急性傳染病，常呈地方性流行或散發（姚新玲等，２０１０）。據新疆阿克蘇地區畜牧獸醫站報道，產前或長期給母豬飼喂腐殖酸鈉，可使所產仔豬對腸道已有的大腸桿菌有較強的抵抗力（蔣安文等，２０００）。走訪牧區蒙古族牧民，發現牧民在養羊過程中使用腐殖酸鈉預防治療羊腹瀉。由于腐殖酸鈉結構復雜，對大腸桿菌作用效果不明，本試驗通過對分離于羊腸道的２株大腸桿菌進行體外抑菌試驗，并對其細胞形態進行觀察來研究腐殖酸鈉對大腸桿菌是否有抑制作用，以期為今后深入探討腐殖酸鈉抑制大腸桿菌的機制提供理論依據。

1、材料與方法

1.1 材料
供試菌株大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４均由內蒙古農業大學獸醫學院提供。腐殖酸鈉購于天津市光復精細化工研究所，含量大于９９％。

1.2 菌種活化
將供試菌株大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４分別接種于 ＬＢ斜面培養基上，于３７ ℃下培養２４ｈ進行活化傳２代。

1.3 稀釋平板計數法
取活化培養好的菌株，用無菌生理鹽水稀釋接入細菌計數液體培養基，使其終濃度為１０６ ＣＦＵ／ｍＬ。分別添加５％、１０％、１５％腐殖酸鈉（ｍ／Ｖ），等量取出不同添加水平腐殖酸鈉菌液調節ｐＨ７．３，３７ ℃靜置培養。依菌株生長情況，取樣時間選擇為４、１２、２４、４８ｈ，細菌計數固體培養基（ｐＨ７．０）稀釋平板法計數菌落（ＣＦＵ／ｍＬ），以不加腐殖酸鈉的細菌培養液為空白對照，每個處理重復３次。測定不同水平腐殖酸鈉及不同水平腐殖酸鈉調節ｐＨ 后對大腸桿菌活菌數的影響。

1.4 透射電鏡觀察
選擇大腸桿菌 Ｃ７８４菌株，分別接種于添加５％腐殖酸鈉、添加５％腐殖酸鈉調節ｐＨ７．３和 空 白 ＬＢ 固 體 培 養 基 中，３７ ℃培 養２４ｈ后收集菌體，按電鏡樣品制備及超薄切片技術（朱麗霞，１９８３）操作，用移液槍沿管壁緩慢加入３％戊二醛固定液，４℃靜置１５～３０ｍｉｎ；１００００～１３０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上 清；用 吸 管 沿 管 壁 緩 慢 加 入３％戊二 醛，再 用 １％ 四 氧 化 鋨 固 定，丙 酮 逐 級 脫 水，Ｅｐｏｎ８１２樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，Ｈ－７０００型透射電鏡觀察。

1.5 統計分析
試驗數據采用 ＳＰＳＳ１０．０統計軟件中 Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ 程序進行方差分析和 ＬＳＤ法進行顯著性差異分析，結果用平均值±標準差表示，以Ｐ＜０．０５為差異顯著性判斷標準。

2、結果與分析

2.1 添加不同水平腐殖酸鈉對大腸桿菌活菌數的影響
由表１可知，大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌數均隨腐殖酸鈉添加量的增加，抑菌效果逐漸增強。其中大腸桿菌 Ｃ１２５在４和１２ｈ時，各濃度間大腸桿菌活菌數差異顯著（Ｐ＜０．０５）；２４和４８ｈ時，添 加５％、１０％、１５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數與對照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），且添加１０％、１５％腐殖酸鈉組與添 加５％腐 殖 酸 鈉 組 相 比 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５）。大 腸 桿 菌 Ｃ７８４在４ｈ時 的 活 菌 數 僅 添 加１５％腐 殖 酸 鈉 組 與 對 照 組 相 比 差 異 顯 著 （Ｐ ＜０．０５），其他組間差異均不顯著（Ｐ＞０．０５）；１２ｈ時，添加１０％、１５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數與對照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸鈉組與對照組相 比 差 異 不 顯 著（Ｐ＞０．０５）；當 時 間 延 長到２４和４８ｈ時，各處理組大腸桿菌活菌數與對照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５）。

2.2 添加不同水平腐殖酸鈉調節ｐＨ后對大腸桿菌活菌數的影響
由表２可知，調節ｐＨ后，大腸桿菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌數均隨腐殖酸鈉添加量的增高而降低。其中大腸桿菌 Ｃ１２５在４、１２和２４ｈ時，各處理組大腸桿菌活菌數與對照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５）；４８ｈ時，添加１０％、１５％腐殖酸鈉組與對照組相比均差異顯著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸鈉組大腸桿菌活菌數與對照組相比差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。大腸桿菌 Ｃ７８４在４ｈ時，各處理組大腸桿菌活菌數與對照組相比差異均不顯著 （Ｐ＞０．０５），時間延長到１２、２４和４８ｈ時，各處理組大腸桿菌活菌數 與 對 照 組 相 比 均 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５），且各處理 組 間 差 異 顯 著（Ｐ＜０．０５）。調 節 ｐＨ 后，腐殖酸鈉對２株大腸桿菌依然有抑制作用，對于不同菌株抑制作用有差異。

2.3 透射電鏡觀察結果
經透射電鏡觀察發現，添加５％腐殖酸鈉組的大腸桿菌細胞質固縮，出 現 空斑，細胞質解體形成小空泡，并連接成大空泡成為空腔（圖１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）；而添加５％腐殖酸鈉調節ｐＨ 組的大腸桿菌細胞內出現大量空泡，且空泡多集中在細胞膜周圍（圖１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）；對照組大腸桿菌菌體呈棒狀，細胞壁完整、邊緣清晰、平整，無缺陷，無裂痕，無質壁分離現象，細胞質、核致密均勻（圖１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ）。

３、討論

隨著腐殖酸鈉本身化學結構、分離提純技術方面研究的不斷深化，其藥用價值逐漸體現，而腐殖酸鈉對有害菌抑制作用方面的研究較少?，F階段研究表明，腐殖酸鈉不僅內服、外用均無不良反應，且靜脈注射亦未見到中毒發生和任何副作用。夏學鵬等（２００９）用含３０％腐殖酸鈉的水溶液對１４窩１１２頭初生仔豬白痢病進行治療試驗，結果發現，仔豬按體重服藥（２．５ｋｇ體 重 每 次５ｍＬ／頭，２．５ｋｇ以 上 體重每次１０ｍＬ／頭），２次／ｄ，對仔豬白痢病具有良好的治療效果，治療中除３頭仔豬未愈外，其余１０９頭仔豬均在服藥后３ｄ內治愈，治愈率達９６％，表明腐殖酸鈉對治療仔豬白痢病具有見效快、成本低、復發率低的優勢。腐殖酸鈉之所以對動物拉稀、痢疾療效較好，主要是它為高分子絡合物，并含生物堿，故對于腸道炎性物和有毒物質有較強的吸附力，同時對腸道黏膜具有收斂作用，由于腐殖酸鈉結構中含有各種活性基團，從而能收縮血管，降低毛細血管滲透性，起到消炎止血作用，因此具有增強機體免疫的能力。目前腐殖酸鈉對細菌的體外抑菌試驗文獻報道極少，本試 驗 在 這 方 面 進 行 了 初 步 嘗 試，結 果 表明，初始不同腐殖酸鈉添加水平對大腸桿菌 Ｃ１２５均有抑制作用，隨時間的延長，抑制作用趨于一致；而對于大腸桿菌 Ｃ７８４，初始只有腐殖酸鈉添加量足夠高才會對其起到抑制作用，隨時間的延長，組間差異越來越顯著。不同水平腐殖酸鈉添加水平作用于大腸桿菌 Ｃ１２５和 Ｃ７８４，在２４ｈ時，活 菌 數 與 對 照組相比顯 著 降 低。在 添 加 不 同 水 平 腐 殖 酸 鈉 調 節ｐＨ 試驗中，大腸桿菌不同菌株活菌數的改變基本一致。腐殖酸鈉作 用 于２株 大 腸 桿 菌，調 節 ｐＨ 與否在１２ｈ后均能達到抑制大腸桿菌的目的。透 射電鏡觀察發現，腐殖酸鈉可使大腸桿菌細胞膜通透性發生改變，使細胞異常生長，抑制對數生長期的細胞分裂，使細胞質稀薄，細胞內部出現空泡，表明腐殖酸鈉可有效抑制大腸桿菌生長。腐殖酸鈉對大腸桿菌生長的抑制作用主要原因有：①腐殖酸鈉改變了菌液ｐＨ 使菌處于過堿環 境，從 而 使 大 腸 桿 菌 的生長繁殖受到抑制；②腐殖酸鈉形成柔性的兩性空間構象后與細胞內膜作用，擾亂了膜脂分子的排列，改變了細胞膜的通透性，影響細胞膜的結構和功能，在細胞膜上形成了許多孔道，致使細胞內的原生質擴散并從孔道向胞外滲漏，造成紫外吸收值升高，影響了細菌的代謝系統，隨著細菌細胞膜破損，最終引起細胞完全解體，從而起到抑菌、殺菌作用（宮霞等，２００７）。

4、結論

本試驗結 果 表 明，添 加５％、１０％、１５％腐 殖 酸鈉可使大腸桿菌活菌數明顯降低；同一菌株隨腐殖酸鈉添加量增加，抑制效果越顯著；不同菌株在相同處理條件下，隨時間的延長，抑制作用越明顯。

作者：娜仁高娃    來源：預混料家園

天俠劍客

腐植酸鈉是個好東西，還有很多作用！