畜牧人
標題: 請大家幫我看看酶活低原因在哪 [打印本頁]
作者: wy0351 時間: 2011-2-14 09:56
標題: 請大家幫我看看酶活低原因在哪
請教大家，幫我看看為什么我5000U的植酸酶測出來總是2000多一些，我用的挑戰的植酸酶。
1、溶液配制：
1.1.乙酸緩沖液(1)：稱取20.52g無水乙酸鈉于1000 ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調節pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。室溫下存放2個月有效。
1.2.乙酸緩沖液(2)：稱取20.52g無水乙酸鈉，0.5 ml TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000ml燒杯中，加入900ml蒸餾水溶解，用冰乙酸調pH至5.50±0.01，移至1000ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，室溫下存放2個月有效。
1.3.硝酸溶液：1+2水溶液。
1.4.鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解（微加熱），加入1ml氨水(25％)，用蒸餾水定容至刻度。
1.5.偏釩酸銨溶液：稱取0.235 g偏釩酸銨于100mL棕色容量瓶中，加50ml蒸餾水微加熱溶解，待溶液冷卻后加入2 mL硝酸溶液(1.3)，用蒸餾水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
1.6.顯色終止液：移取2份硝酸溶液(1.3)，1份鉬酸銨溶液(1.4)，1份偏釩酸銨溶液(1.5)混合后使用，現用現配。
1.7．植酸鈉溶液：（sigmaP0109）稱取0.69g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(2)溶解并定容至刻度，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。
1.8基準物：準確稱取0.6804g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（1）溶解，準確定容至刻度（濃度為50.0µmol/ml）。
2、測定步驟：
2.1.標準曲線：
按下列圖表用乙酸緩沖液(2)稀釋成不同濃度，與待測試樣一起反應測定
標準稀釋比例
2.2.樣品溶液制備：
準確稱取植酸酶試樣1g，置于100ml容量瓶中，加入乙酸緩沖液（2）搖勻并定容至刻度，放入磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌40min，將提取后的試樣在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液1ml于100ml容量瓶中，用乙酸緩沖液（2）定容至刻度，使樣液濃度保持在0.5U/ml左右，待反應。
2.3．反應步驟：
取9支刻度試管，按下面順序進行操作，標準空白加0.2ml乙酸緩沖液(2)，
2.4．樣品測定
反應后將試樣在常溫下靜置10min，出現渾濁，然后在離心機上以4000r/min離心15min，取上清液以標準空白調零，在分光光度計波長為415nm處測出各個吸光值。
以吸光值為橫坐標，摩爾量為縱坐標作圖。Y=kx+b
3.計算公式：
U=yn/0.2mt
U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
y——根據實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的無機磷的量，（μmol）
n——試樣溶液反應前的總稀釋倍數,10000；
m——試樣質量g；
t——反應時間min。30min
作者: 海上龍卷風 時間: 2011-2-14 10:24
不同測定方法下酶活表現不一樣
作者: liyunhuddt 時間: 2011-2-14 10:48
要看你是不是和對方提供的檢驗方法一樣
作者: xyy169 時間: 2011-2-14 14:37
植酸酶是有國標方法的，你這個好像就是國標。
但酶制劑的檢測，不僅只是檢測方法的問題，更要注重的是操作細節，一個細節可能就是上幾倍，十幾倍的差距。
注意一下以下幾個方面：1、酶的溶出過程，包括時間，方法；2、緩沖液2中的牛血清白蛋白等是否有加（對有些植酸酶的影響非常大）；3、確定一下反應溫度，可另用溫度計測試；4、加底物量是否一致，包括間隔時間等細節多注意一下。
另外你拿一個你可以檢測到5000單位的標準樣品進行對比檢測，以確定你的操作和儀器是否正確等。
作者: wy0351 時間: 2011-2-14 16:50
回復 xyy169 的帖子
樓上的，您好，我測的是直接的植酸酶，高速磁力攪拌40min，不加熱的。緩沖液2中的牛血清白蛋白，去痛100我也都加了。水浴鍋溫度控制在37.0℃。加底物和終止液都是用的1~5ml量程移液槍加的。唯一一個間隔的時間我沒有太在意。我感覺連續加，時間不會差多少吧。難道就是這個在影響嗎？
作者: tianfangxu 時間: 2011-2-15 21:13
您好，我也是做酶制劑檢驗的，上次我也做了植酸酶，沒做出來，我把做曲線和做樣的曲線加的緩沖溶液加的搞錯了，我做曲線不是加的緩沖液，我加的蒸餾水。我希望我們可以多多交流酶制劑方面的問題。我最近又在糾結糖化酶......
補充內容：
您稀釋的是10000倍吧，您測的植酸酶活性是多大的？
作者: wy0351 時間: 2011-2-16 09:33
回復 tianfangxu 的帖子
我測的是5000U的植酸酶，稀釋10000倍
作者: wy0351 時間: 2011-2-16 11:36
回復 tianfangxu 的帖子
我前一段做一幾天糖化酶。。。
作者: hxz001 時間: 2011-2-16 14:11
4樓的意見比較客觀
作者: akenuma 時間: 2011-6-23 17:09
我們檢測稀釋800倍
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