制備有機鉻添加劑——鉻酵母的研究 郝素娥 陳慶峰 劉旭 劉亞斌 摘 要 利用生物合成法制備了一種有機鉻含量較高的新型添加劑——鉻酵母，并采用分光光度法及透析處理測定了鉻酵母中總鉻和有機鉻的含量，從而確定了鉻酵母的最佳制備條件為：培養(yǎng)基采用麥芽汁+尿素，培養(yǎng)基中三氯化鉻的添加量為1.6 μg。ml－1，啤酒酵母的接種量為3%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為48 h。 關鍵詞 鉻酵母 有機鉻 添加劑 1 前言 鉻是生物體必需的微量營養(yǎng)元素，人體缺鉻會產生葡萄糖、脂肪、蛋白質代謝障礙，引起各種疾病，如動脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病、末梢神經炎、近視眼等，尤其嬰兒缺鉻易患消瘦性蛋白質營養(yǎng)不良癥［1］；動物缺鉻表現(xiàn)為膽固醇或血糖升高、生長遲緩、免疫力下降、繁殖能力降低和壽命縮短等，如禽類喂含鉻量低于5 μg。kg－1的飼料日糧時，羽毛大量脫落；用低鉻日糧喂兔，則母兔產仔率下降；用無鉻日糧喂種公牛，精液量大大減少，精子畸形率顯著提高。當補鉻后，癥狀消失［2］。 在研究鉻的補充時，主要有無機鉻(常用CrCl3。6H2O、Cr2(SO4)3、Cr(NO3）3）和有機鉻(常用煙酸鉻、蛋白螯合鉻、鉻酵母)兩種形式。鉻的生物活性的發(fā)揮需要三價鉻，鉻主要以Cr3＋構成葡萄耐量因子(GTF)，協(xié)助胰島素作用，影響糖類、脂類、蛋白質和核酸的代謝。鉻進入體內，經腸道吸收，在血液里與運送鐵的球蛋白結合，而后被運至肝臟及全身。由于不同形式的鉻在組織中的結合程度不同，導致吸收率不同，因此鉻的吸收與化學結合形式有很大關系，飼料中的總鉻含量不能反映可利用鉻或鉻的營養(yǎng)狀況。無機鉻不但毒性大，且以極低水平吸收，約為0.4%～3％；有機鉻安全性高，且易被吸收，吸收率約為10%～25%［3］。瑞士聯(lián)邦學院畜牧所Gebert和Wenkin的研究表明，煙酸鉻和酵母鉻的效果明顯好于氯化鉻，尤以酵母鉻最佳［4］。鉻酵母是以生物方法制備的，具有生物活性高、毒性小、生產成本低等特點，可以認為是一種具有較好應用前景的鉻的補充物。 本文利用生物合成法制備了有機鉻含量較高的鉻酵母，并對所制備的鉻酵母中的總鉻和有機鉻的含量進行了分析測定，從而確定了制備鉻酵母的最佳條件，為鉻酵母今后在醫(yī)藥及添加劑領域的應用奠定了必要的基礎。 2 實驗方法 2.1 鉻酵母的制備過程 培養(yǎng)基調制→滅菌→濾蛋白→添加氯化鉻→滅菌→接種酵母菌→培養(yǎng)→離心→水洗→干燥→粉碎→成品 2.2 鉻酵母中總鉻及有機鉻含量的測定 鉻(Ⅵ)可與對氨基二乙基苯胺發(fā)生氧化反應，生成紅色化合物，利用分光光度法可以測定鉻酵母中的鉻含量，最大吸收波長為540 nm［5,6］。 鉻酵母經消化進行測定，即為鉻酵母中的總鉻含量；將鉻酵母進行透析處理，使有機鉻與無機鉻分離，便可測得鉻酵母中有機鉻的含量。 3 實驗結果與討論 在鉻酵母的制備過程中，鉻酵母中的總鉻含量及有機鉻含量與培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)基中CrCl3。6H2O的添加量、酵母菌種及其接種量、以及培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間均有關。 3.1 培養(yǎng)基的種類對鉻酵母中鉻含量的影響 文中采用了四種不同的培養(yǎng)基進行實驗，實驗結果見表1。 表1 培養(yǎng)基對鉻酵母中鉻含量的影響μg/g |
培養(yǎng)基種類 | 麥芽汁 | 麥芽汁＋尿素 | 麥芽汁+葡萄糖 | 人工培養(yǎng)基 |
總鉻 有機鉻 | 84.28 75.05 | 124.75 109.36 | 122.40 101.88 | 91.65 67.48 |
| 從表1可以看出，當麥芽汁中添加一定量尿素或葡萄糖時，酵母對培養(yǎng)基的利用率較高，其轉化無機鉻為有機鉻的能力也較強；利用人工培養(yǎng)基(葡萄糖加無機鹽等)也可制備鉻酵母，但從制備效果和經濟效益上考慮，均不如采用天然培養(yǎng)基為好。 3.2 培養(yǎng)基中CrCl3。6H2O添加量對鉻酵母中鉻含量的影響 在鉻酵母的制備過程中，對鉻酵母中總鉻含量及有機鉻含量影響最大的因素是培養(yǎng)基中CrCl3。6H2O的添加量。由表2可知，隨著培養(yǎng)基中CrCl3。6H2O添加量的增加，鉻酵母中的總鉻含量及有機鉻的含量開始的時候亦呈增加趨勢，但達到一定水平后又呈下降趨勢。這說明酵母能夠利用培養(yǎng)基中的無機鉻并將其轉化為有機鉻，但培養(yǎng)基中無機鉻的濃度不能太高，濃度太高時會對酵母的生長產生抑制作用。培養(yǎng)基中CrCl3。6H2O的最佳濃度為1.6 μg。ml－1。 表2 CrCl3。6H2O添加量對鉻酵母中鉻含量的影響 |
CrCl3/μg。ml－1 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2.0 | 2.4 |
總鉻/μg。g－1 有機鉻/μg。g－1 | 40.08 28.25 | 77.64 53.19 | 113.15 90.92 | 124.75 109.36 | 108.76 88.12 | 89.35 69.87 |
| 3.3 酵母菌種及接種量對鉻酵母中鉻含量的影響 分別用面包酵母和啤酒酵母進行實驗，在相同的實驗條件下，用面包酵母的時候，鉻酵母的總鉻含量較高，而用啤酒酵母時，雖總鉻含量稍低些，但其有機鉻含量卻較高，因此認為還是啤酒酵母較好些，實驗結果見表3。另外，酵母菌的接種量對實驗結果也有一定的影響，實驗表明，接種量為3%時，效果最好。 表3 酵母菌種對鉻酵母中鉻含量的影響 |
酵母菌種 | 面包酵母 | 啤酒酵母 |
總鉻/μg。g－1 有機鉻/μg。g－1 | 90.05 67.96 | 84.28 75.05 |
| 3.4 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對鉻酵母制備的影響 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對鉻酵母中總鉻含量及有機鉻含量亦有一定的影響。分別進行了培養(yǎng)溫度為20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃培養(yǎng)時間為24 h，36 h，48 h，60 h,72 h的實驗，結果表明，當培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間為48 h時，鉻酵母的制備效果最好。 3.5 鉻酵母的紅外光譜分析 在鉻酵母的紅外分析譜圖上可以看出(圖1)，在3 371.37 cm-1，1 654.83 cm－1，1 237.26 cm－1，521.71 cm－1處有較強的吸收峰，它們分別為氨基，碳—碳鍵，羧基，以及三價鉻的吸收峰，且發(fā)生了不同程度的移動，這說明在鉻酵母中存在著碳—鉻鍵，鉻是以有機鉻的形式存在的，而且很有可能是以鉻氨基酸的形式存在的［7］。由于含鉻氨基酸的標準樣難以得到，鉻酵母中有機鉻的準確形式還有待于進一步研究。 |
鉻酵母作為一種生理活性高，毒性小，成本低的有機鉻添加劑，其開發(fā)生產必將產生巨大的社會效益和經濟效益。 作者單位：哈爾濱工業(yè)大學應用化學系(150001) |
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